肿瘤坏死因子α功能抑制剂对肺气肿大鼠气道炎症的影响

                      作者：李军利, 陈平, 张程, 张湘燕

【摘要】  目的： 探讨肿瘤坏死因子α（TNF?α）抑制剂——重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（rhTNFR:Fc）对肺气肿大鼠气道炎症的影响。方法: 48只大鼠分为正常对照组、肺气肿组、rhTNFR:Fc干预组（干预组）和干预对照组，单纯吸烟法建立肺气肿模型；后3组烟雾暴露达1月时，干预组给予rhTNFR:Fc进行干预，干预对照组给予空白对照制剂；熏烟80 d后，处理所有大鼠，正常对照组和肺气肿组肺组织切片行苏木素-伊红染色观察形态学改变，定量测定肺平均内衬间隔（MLI）、平均肺泡数（MAN）；支气管肺泡灌洗液（BALF）计数各组白细胞总数、中性粒细胞和巨噬细胞计数及其百分比，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组血清及BALF中的TNF?α浓度。结果: (1)肺气肿组MLI高于正常对照组，MAN低于正常对照组（P＜0.05）；(2)肺气肿组血清TNF?α浓度高于正常对照组和rhTNFR:Fc干预组（P＜0.05），和干预对照组比较差异无显著性（P＞0.05）；肺气肿组BALF中TNF?α浓度高于正常对照组（P＜0.05），但和rhTNFR:Fc干预组、干预对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；(3)肺气肿组BALF中白细胞总数、中性粒细胞计数及百分比高于正常对照组（P＜0.01，P＜0.05和P＜0.05）和rhTNFR:Fc干预组（P＜0.01，P＜0.05和P＜0.05），与干预对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论: TNF?α与吸烟大鼠的肺气肿形成有关，并影响其气道炎症；rhTNFR:Fc对减轻其气道炎症具有一定作用。

【关键词】  重组人融合蛋白质类； 肺气肿； 肿瘤坏死因子?α； 气道炎症

　　［Abstract］Objective: To investigate the effects of tumor necrosis factor?α (TNF?α) inhibitor and recombinant human tumor necrosis factor?Fc (rhTNFR:Fc) on airway inflammation of emphysema rat models. Methods: Forty?eight rats were randomly divided into 4 groups: normal control group (group N),  emphysema group (group E),  rhTNFR:Fc?interfered group (group R) and interfering control group (group I). Emphysema rat models (rats in groups E, R, and I) were established by exposure to cigarette smoking daily for 1 month. Rats in group R were then treated with rhTNFR:Fc and those in group I were injected with certain praeparatum instead. After being exposed to cigarette smoking for 80 days, all of the animals were sacrificed and lung tissue sections were made and stained by hematoxylin and eosin（HE）, upon which morphological changes were observed, mean linear intercept (MLI）and mean alveolar number (MAN) were determined. The levels of TNF?α in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were detected with ELISA. Total cell counts, neutrophil counts and neutrophil proportion in BALF were examined. Results: MLI was higher and MAN was lower in group E than those in group N. Serum TNF?α level was significantly higher in group E than those in groups N and R (P﹤0.05 ), but did not differ from that in group I （P＞0.05）. TNF?α level in BALF was higher in group E than that in group N (P﹤0.05), but was not significantly different from those in groups R and I. Total cell counts, neutrophil counts, and neutrophil proportion in BALF were higher in group E than those in groups N and R (P﹤0.01, P﹤0.05, P﹤0.05) but were not statistically different from those in group I. Conclusions： TNF?α contributes to the pathogenesis of emphysema and affects airway inflammation. rhTNFR:Fc may play a role in reduction of airway inflammation in rat models of emphysema.

　　［Key words］recombinant fusion proteins; emphysema; tumor necrosis factor alpha; airway inflammation 
   
　　肿瘤坏死因子α（TNF?α）能参与慢性阻塞性肺疾病（COPD）气道炎症的形成[1]，因此在肺气肿等发病中的作用越来越受到重视。2007年1月～2008年4月，采取单纯香烟熏吸方法建立肺气肿大鼠模型，观察TNF?α抑制剂——重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对吸烟大鼠血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF?α水平、BALF中炎症细胞计数和分类的影响，旨在探讨TNF?α和肺气肿气道炎症的关系以及rhTNFR:Fc的干预作用，为临床上寻找可行的方法提供理论依据。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 

　　48只雄性SD大鼠（中南大学湘雅二实验动物中心提供）体重187～240 g，鼠龄10周。

　　1.2 实验材料 

　　芙蓉牌香烟为湖南常德卷烟厂出品，焦油13 mg/盒。rhTNFR:Fc（益赛普）为上海中信国建药业有限公司产品，批号20060101，12.5 mg/瓶(rhTNFR:Fc12.5 mg，甘露醇 40 mg，蔗糖10 mg， 三羟甲基氨基甲烷1.2 mg)。大鼠TNF?α ELISA检测试剂盒购于R & D公司 。

　　1.3 分组处理 

　　将大鼠随机分为正常对照组、肺气肿组、干预组和干预对照组，每组12只。正常对照组自由摄食饮水，不做任何处理；肺气肿组、干预组及干预对照组大鼠放在自制的有机玻璃箱(69 cm×47 cm×38 cm)中给予被动吸烟，同时点燃5支香烟，放入箱内燃烧，至香烟燃烧完全、烟雾基本消失，共计15 min。然后，掀开箱盖，同时驱赶大鼠，此为第一次烟雾暴露。休息5 min后，重复1次烟雾暴露，此后，取出大鼠，清洗烟雾暴露箱，3 h后重复上述烟雾暴露。每天烟雾暴露4次，每周6 d。烟雾暴露达1月时，以rhTNFR:Fc对干预组进行干预，皮下注射，每周2次，每次每只鼠0.6 mg；干预对照组给予对照制剂皮下注射，（每次每只鼠给予的对照制剂含生理盐水0.1 ml，甘露醇0.8 mg，蔗糖0.2 mg， 三羟甲基氨基甲烷0.024 mg），每周2次。肺气肿组、rhTNFR:Fc干预组各有1只大鼠分别在第50天及第45天死亡；干预对照组第20天及第62天各死亡1只，原因均不明。76 d后停用rhTNFR:Fc干预，80 d后，终止所有处理，作以下检测。

　　1.4 血清和BALF收集及TNFα测定 

　　以10%的水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠。切开分离下腔静脉，抽取静脉血5 ml，在5 ℃、500 r/min的适宜条件下进行血清分离15 min，吸取血清，-70 ℃冰箱中保存待测。随后，经下腔静脉继续抽血处死大鼠，将气管与双肺暴露，做气管下部横行切口，结扎右主支气管，用接12号针头（尖端磨平）的注射器经气管切口向左肺缓慢灌注无菌生理盐水3 ml，每次灌注后立即回收灌注液（回收率为80％～90%），并经纱布过滤，重复3次。吸取0.5 mlBALF到血细胞计数器上计数细胞总数,取其上清液移入无菌瓶内,并放在-70 ℃的超低温冰箱中待测。细胞沉淀重新混悬于PBS液，制作4张细胞涂片，Wright?Giemsa染色作细胞计数（至少计数200个细胞）。剩余的BALF离心处理，取其上清液移入无菌瓶内，放在-70 ℃的超低温冰箱中待测。按照试剂盒说明书的要求测定TNF?α浓度。

　　1.5 大鼠肺组织病理切片及分析 

　　处死大鼠后，取右下肺，10%中性福尔马林固定、石蜡包埋切片，常规苏木素-伊红（HE）染色。光学显微镜（OLYMPUS BX41TF）观察。每只大鼠取3个HE染色切片，每片随机取3个视野(避开大血管和支气管),在每个视野正中心划“十”字交叉线,与交叉线相交的肺泡隔数 (NS)和每个视野内肺泡数(Na),同时测出“十”字线总长(L)和每个视野面积(S),按公式计算肺平均内衬间隔（MLI）=L/NS,以表示肺泡平均内径。按公式计算平均肺泡数（MAN）=Na/S,以此反映肺泡密度。

　　1.6 统计学处理 

　　计量资料用（x±s）表示。采用方差分析、秩和检验及t’检验。P＜0.05为差异具有显著性。

　　2 结果

　　2.1 大鼠肺组织的病变化 

　　肺气肿组大鼠支气管及肺内出现以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，纤毛脱落，杯状上皮细胞化生，肺泡壁变薄，部分肺泡破裂，肺泡腔扩大；MLI高于正常对照组,MAN低于正常对照组（P＜0.05）,提示肺气肿模型已成功建立，单纯吸烟即可引起肺气肿形成。见表1、图1和图2。表1  两组大鼠MLI、MAN比较（略）注：与正常对照组比较,P＜0.05；MLI：肺平均内衬间隔，MAN：平均肺泡数。

　　2.2  血清和BALF中TNF?α水平  肺气肿组血清TNF?α高于正常对照组和干预组(P＜0.05)，肺气肿组BALF中TNF?α浓度高于正常对照组(P＜0.05)。见表2。表2  各组大鼠血清和BALF中肿瘤坏死因子α水平（略）注：(1)与正常对照组比较,P＜0.05；(2)与干预组比较，P＜0.05。

　　2.3 BALF中细胞计数和分类计数 

　　肺气肿组BALF中白细胞总数、中性粒细胞百分比及其绝对值均高于正常组（P＜0.01，P＜0.05和P＜0.05）和干预组（P＜0.01，P＜0.05和P＜0.05），结果见表3。表3  各组大鼠BALF中细胞计数和分类计数（略）注：(1)与正常对照组比较，P＜0.01，(2)P＜0.05;(3)与干预组比较， P ＜0.01,(4)P＜0.05。

　　3 讨论
    
　　通过熏香烟的方法复制大鼠肺气肿模型,病理学检查显示肺气肿组大鼠支气管肺内出现以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，纤毛脱落，杯状上皮细胞化生，肺泡壁变薄，部分肺泡破裂，肺泡腔扩大；MLI 较正常对照组增加而MAN较正常对照组减少,呈现肺气肿样改变，提示吸烟模型已成功建立，单纯吸烟即可引起肺气肿形成。
    
　　TNF?α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，可参与机体脂肪、蛋白质的分解代谢等病理生理过程，对肺气肿的发生和有促进作用[2]。本组研究表明，肺气肿大鼠血清及肺泡灌洗液TNF?α水平较正常对照组升高，二者差异有显著性,表明其在肺气肿气道炎症中有重要作用。

　　目前认为，TNFα诱发气道炎症形成、促进肺气肿甚至COPD发展的原因主要包括以下三个方面。(1)TNFα对白细胞有趋化作用，刺激内皮细胞表达血管细胞黏附因子（VCAM1），导致白细胞外渗，并向炎症部位迁移，启动炎症反应的发生；TNFα还可直接作用于气道上皮，诱导气道黏液细胞化生和高分泌，或促进上皮细胞IL1、TNFα、IL?8等受体的表达，因此可能参与上皮细胞的损害和肺气肿的形成[3]。(2)TNFα还能诱导气道上皮细胞和中性粒细胞生成IL?8，增强中性粒细胞在细胞外的蛋白分解作用，促进炎症反应、血管生成和组织纤维化[4]。(3)刺激巨噬细胞MMP?9产生[5,6]。重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白[rhTNFR:Fc,益赛普,(etanercept)]，是一种TNF结合蛋白,能竞争性地与TNF?α结合，阻断它和细胞表面TNF受体结合，降低其活性,现已广泛用于类风湿关节炎等疾病[7]，但对呼吸系统常见疾病如肺气肿的疗效尚未见报道。有资料表明，小鼠同种异体骨髓移植术后，TNF?α在肺泡灌洗液中的浓度升高并导致肺部病理改变，使用rhTNFR:Fc处理后，其肺部损害也相应减轻[8]，提示该药可能对改善相关肺部疾病具有重要意义，其对肺气肿是否有确切的疗效值得进一步研究证实。
    
　　实验表明，使用rhTNFR:Fc干预后，吸烟大鼠血液中TNFα的浓度低于肺气肿组大鼠（P＜0.05），但肺泡灌洗液中的浓度和肺气肿组大鼠差异无统计学意义（P＞0.05）,说明该药虽能明显降低血液中TNFα的浓度，但对肺泡灌洗液中的TNFα浓度影响不大，除考虑结果的客观存在以外，还有可能和样本例数较小，试验误差等原因有关。rhTNFR:Fc干预组BALF中中性粒细胞百分比以及绝对值较肺气肿组相应降低，差异有统计学意义，一方面进一步验证了TNFα在肺气肿发病中的重要作用，另一方面还提示rhTNFR:Fc通过和TNFα结合能显著减轻气道炎症，因此在肺气肿的防治中可能具有重要的临床价值。由于本实验以大鼠为研究对象，TNFα对人类肺气肿的确切疗效仍需临床实验进一步证实。

【】
  　　[1]张永,程德云,王慧,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠肺内白细胞介素?8和肿瘤坏死因子α与气道炎症的关系研究[J].呼吸与危重监护杂志,2003（6）：355-359

　　[2]钟小宁,白晶,施焕中,等. 慢性支气管炎与肺气肿大鼠气道炎症与重塑的实验研究[J].中华结核和呼吸杂志,2003（12）：750-755

　　[3]De Boer WI.Cytokines and therapy in COPD:a promising combina? tion[J].Chest,2002(3):209-218

　　[4]王胜,徐凤珍,陈余清.慢性阻塞性肺疾病患者痰液白细胞介素8、6和肿瘤坏死因子测定及其意义[J].中华结核和呼吸杂志,2000（8）:465-467

　　[5]李亚清,张珍祥,徐永健,等.COPD患者肺泡巨噬细胞源性MMP?9的表达及其酶活性变化[J].中华内科杂志,2006(1):38-41

　　[6]Andrew Churg,Rong D Wang, Hsin Tai,et al.Tumor necrosis factor?α drives 70% of cigarette smoke?induced emphysema in the mouse[J].American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine,2004(170):492-498

　　[7]胡大为,鲍春德,陈顺乐,等.重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白治疗类风湿关节炎双盲随机多中心对照临床研究[J].中华风湿病学杂志,2005（11）:664-668

　　[8]Gerbitz A,Nickoloff BJ,Olkiewicz K,et al.A role for tumor necrosis factor?alpha?mediated endothelial apoptosis in the development of experimental idiopathic pneumonia syndrome[J].Transplantation,2004(4):494-502.