免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

【摘要】  目的： 探讨用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法： 收集小鼠骨髓细胞, 台盼蓝染色观察其活力，用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果； 未分选前CD117细胞纯度为(41.56±18.77)%，MACS分选CD117细胞纯度(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P<0.05）。结论： MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。

【关键词】  造血干细胞 CD117+细胞 免疫磁珠分离法 小鼠 近交BALBC

造血干细胞（HSCs）研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞,并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。C?Kit或干细胞因子受体SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要标志[3]，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。

    1  材料和方法

    1.1  实验动物

    BALB/C小鼠,(20±1)g,雌雄随机,10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

    1.2  试剂和仪器

    BSA购自杭州四季青生物工程材料研究所,荧光标记小鼠抗体CD117?PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自Miltenyi Biotec公司,流式细胞仪(FACS Calibur)购自BD公司。

    1.3  实验方法

    1.3.1  小鼠骨髓细胞收集

    颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1 ml注射器（带4号针头）插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1 500 r/min离心10 min，小心去除上清液，加入5 ml缓冲液混匀，进行细胞计数。

    1.3.2  MACs分离CD117细胞

    1.3.2.1  小鼠系别细胞去除  用缓冲液按40 μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育10 min。加入缓冲液30 μl/107个细胞，20 μl抗生物素微珠，混匀，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液。

    1.3.2.2  磁性标记和分选CD117细胞  将分选后得到的细胞用缓冲液按80 μl/107个细胞重悬。加入CD117微珠20 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育15 min，缓冲液1 ml/107个细胞洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清，用500 μl缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1 500 μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞。

    1.3.3  流式细胞仪分析

    将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100 μl缓冲液，10 μl CD117抗体混匀，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl缓冲液1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液，加入500 μl缓冲液混匀，送流式细胞分析,设阴性对照和空白对照。

    1.3.4  细胞染色计数

    0.4% 台盼蓝按9∶1（V∶V，细胞悬液量：染色液量）对细胞进行染色。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。细胞活力的测定: 0.4% 台盼蓝染色1 min，活细胞率，活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

    1.4  统计学处理

    用SPSS 11.1进行统计学数据分析，用配对样品t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  骨髓细胞的收集

    从1只小鼠股骨、胫骨可收集5.25×107个骨髓细胞，细胞活力90%，2只小鼠股骨、胫骨可收集8.48×107个骨髓细胞，细胞活力92%。

    2.2  MACS分选造血干细胞

    1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个造血干细胞。

    2.3  流式细胞仪分析结果

    免疫磁珠纯化前CD117阳性细胞纯度为（41.56±18.77)% ，纯化后CD117阳性细胞纯度为(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P<0.05）。经免疫磁珠纯化后、未经免疫磁珠纯化小鼠骨髓干细胞收集物，流式细胞仪测定CD117+阳性细胞的纯度见图1。

　　3  讨论

    骨髓内主要有两类干细胞群体,即造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)和间充质干细胞(MSCs)。HSCs是卵黄囊、胎肝和骨髓中比例极小的细胞群, 成年小鼠HSCs占整个骨髓细胞的0.01%～0.05% [4]，具有自我更新的能力, 能维持宿主终生造血功能和分化，生成血液中的各种成熟细胞[5]，获取高度均一的HSCs是开展细胞生物学特性等各项研究的基础。

    CD117干细胞因子受体是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体,广泛分布于HSCs群中,60%～75%的CD34+造血干细胞同时表达CD117，其配体——干细胞因子(SCF,)在HSCs的生存和增埴、分化中起着重要作用。研究发现CD34+CD117+比CD34+CD117-细胞具有更高的集落形成能力，而 CD117可高频率表达于多能干细胞表面,对HSCs的分化具有重要作用,是小鼠HSCs的重要标志[6]。CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面[7]。

    细胞分离或纯化的目的是收获高纯度保持原有活性的单一细胞群，并最大限度地减少靶细胞的丢失。免疫磁珠是一种包被有单克隆抗体的磁性微粒, 它可特异性地与靶物质(细胞、蛋白质、DNA 和细菌等) 结合, 使之具有磁顺应性, 继而在外加磁场的作用下被滞留, 从而与其他成分分离, 达到富集纯化的目的[8，9]。MACS 根据最终选留物质的不同可分为阳性选择(留取与磁珠结合的阳性物质) 和阴性选择(留取不与磁珠结合的阴性物质)。本实验采用免疫磁珠(MACS) 阳性选择法分选HSCs，从1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个HSCs，先进行系别细胞去除的阴性分选，去除成熟造血细胞（T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、粒细胞、红系细胞及其定向前体细胞），细胞与一系列生物素化的抗系别抗原抗体和抗生物素磁珠共同孵育，磁性标记后去除系别细胞，这种标记过程保留了系别标志阴性的细胞，可根据CD117的表达对这些细胞做进一步的磁珠阳性分选。磁珠体积极小,不会对细胞造成机械性压力,孵育时间短,操作过程快,磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成，从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。

    根据HSCs表达或不表达某些细胞表面分子,采用相应的荧光素标记抗体进行免疫染色,根据阳性、阴性选择原理,应用流式细胞仪分选获得具有某些细胞表面特征的细胞。本实验采用流式细胞仪分析计数，免疫磁珠纯化前小鼠骨髓CD117阳性细胞为(41.56±18.77)%，经免疫磁珠纯化后CD117阳性细胞百分比为(88.68±4.74)%，表明MACS是一种安全、有效并实用的分选HSCs CD117的方法，省时、简便、纯度高。

【】
  [1]姚恒美,陈浩明,黄璐,等.小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达[J].复旦学报(版),2005（4）：503-506.

[2]Clotilde Castaldo, Franca Di Meglio, Daria Nurzynska,et al. CD117-positive cells in adult human heart are localized in the subepicardium, and their activation Is associated with laminin-1 and 6 Integrin expression[J]. Stem Cells,2008(26)：1723 - 1731.

[3]裴雪涛.干细胞生物学[M].北京:科学出版社,2003:27-29，107-114.

[4]Lemieux M E, Rebel V I, Landsdorp P, et al.Characterization and purification of a primitive hematopoietic cell type in adult mouse marrow capable of lymphomyeloid differentiation in long-term marrow switch culture[J].Blood,1995(86):1339-1347.

[5]Wagers AJ , Christensen JL ,Weissman IL.Cell fate determ inaton from stem cells[J].Gene Therapy,2002（9）:606-612.

[6]姜亚卓,田普训，丁小明,等.小鼠骨髓CD117+造血干细胞定向分化为未成熟树突状细胞及其鉴定[J].南方医科大学学报,2007（27）：450-453.

[7]董兴高.造血干细胞的研究进展[J].湖北民族学院学报（医学版），2005(22)：47-49.

[8]Wynler EA, Coutinho LH, Marsh JC, et al. Comparision of purity and enrichment of CD34+ cell of bone marrow,umbilical cord and peripheral blood (primed of apheresis) using five separation systems[J].Stem Cell, 1995(13):524-532.

[9]Nishi H, Nishimura S, Higashiura M , et al. A new method for histamine release from purified perpheral blood basoph ilsusingmonoclonal antibody coatedmagnetic beads[J].J Immunol Methods, 2000(24):39-46.