肝细胞性肝癌患者介入治疗前后血清蛋白质组的变化

【摘要】  　　目的用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片检测肝细胞性肝癌(简称肝癌)患者介入前后血清蛋白质组的变化，初步探讨肝癌介入治疗的药物靶点。方法应用SELDI-TOF-MS蛋白质芯片检测50例未经治疗的肝癌患者、50例介入治疗的肝癌患者，获得弱阳离子交换芯片(weak cationic exchanger)蛋白表达图谱，BioMarker Wizard软件分析差异蛋白。结果未经治疗的肝癌患者和介入治疗的肝癌患者血清中检测到不同质荷比处有3个差异蛋白质峰，其蛋白质含量差异有统计学意义(P<0.05)。数据库搜索这3个蛋白质峰，得到3种与之分子量最为接近的蛋白质。　结论　应用SELDI-TOF-MS筛选肝癌患者介入治疗的药物靶点快速、有效，检测到的3个差异蛋白质可能是肝癌患者介入治疗的药物靶点。

【关键词】  肝细胞性肝癌 蛋白质组学 药物靶点 SELDI 蛋白质芯片

　　Abstract:Objective To detect the serum proteomic patters in hepatocellular carcinoma（HCC） patients treated by interpose chemotherapy by using SELDI-TOF-MS（surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry） protein chip array technology, screen drug targets, evaluate its clinical significance.Methods 50 cases of the patients with hepatocellular carcinoma without receiving any therapy, 50 cases of the patients with hepatocellular carcinoma receiving the interpose chemotherapy were tested by weak cationic exchanger protein chip and surface-enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry. The diagnostic models were developed and validated by BioMarker Wizard.Results At the different M/Z value range, three proteins were obviously different in the group of the patients with hepatocellular carcinoma without receiving any therapy, the patients with hepatocellular carcinoma receiving the interpose chemotherapy. Through searching databases we have got three probably significant proteins related with them.Conclusions Detection of serum proteomic patters for hepatocellular carcinoma treated by interventional therapy using SELDI-TOF-MS protein chip array is quick and effective. These differential proteins could be drug targets of hepatocellular carcinoma before and after the interpose chemotherapy in the serum.

　　Keywords:Hepatocellular Carcinoma; Proteomics; Drug targets; SELDI; ProteinChip

　　目前肝癌发病率在我国呈上升趋势，其死亡率占恶性肿瘤死亡率的前列，每年新发肝癌病例约11.02万例，占全世界发病人数42.5%。一些肝癌尤其是多发性或大肝癌往往丧失手术机会而选择经肝动脉介入治疗，而寻找介入治疗的药物靶点对于进一步提高肝癌临床治疗水平具有重要意义[1]。近年来，蛋白质组学研究迅猛，它旨在整体水平上研究细胞或组织内蛋白质组成及其活动。表面增强激光解吸电离(SELDI)蛋白质芯片技术是近几年迅速发展起来的一种蛋白质组学研究的新技术[2，3]。本研究应用SELDI飞行时间质谱对未经治疗的肝癌患者和经介入治疗的肝癌患者血清蛋白质组进行分析对比，筛选可用于肝癌介入治疗的药物靶点。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源 天津医科大学附属肿瘤经病理诊断肝癌100例，其中未经治疗的肝癌患者50例,男30例，女20例，年龄(42～63)岁;经肝动脉介入化疗后3个月的肝癌患者50例，男40例，女10例，年龄(45～67)岁。参照1977年全国肝癌防治研究协作会议肝癌临床分期方案[4]，Ⅰ期：无明确肝癌症状和体征;Ⅱ期：超过Ⅰ期标准，而无Ⅲ期证据;Ⅲ期：有明显恶病质、黄疸、腹水或远处转移之一，50例未经治疗的肝癌患者中，Ⅰ期4例，Ⅱ期36例，Ⅲ期10例;50例经肝动脉介入化疗的肝癌患者中，Ⅰ期2例，Ⅱ期38例，Ⅲ期10例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 仪器和试剂 尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)二乙胺]-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、乙腈、三氟乙酸、芥子酸(sinapinic acid,SPA)均购自美国Sigma公司，弱阳离子交换芯片、蛋白质芯片仪和SELDI飞行时间质谱仪为美国CipherGen公司。

　　1.2.2 标本采集及血清样的制备 各采集静脉血(2～3)ml，立即放入4℃低温冰箱放置2h，4℃ 2000r/min离心30min，收集血清(不能溶血)。将血清50μl/管分装置于-80℃冰箱保存。检测时融解冰冻血清后10 000 r/min，4℃离心10min。取20μl血清于1.5ml离心管中，每管中加30μl U9缓冲液(9mol/L尿素，2%CHAPS，1%DTT)，4℃ 200r/min振荡20min，使血清蛋白变性。每管中再加入100μlU1缓冲液(100μlU9+900μl50mmol/IHEPES pH7.0),4℃ 200r/min振荡30min。

　　1.2.3 芯片的预处理 弱阳离子交换芯片的预处理：芯片每孔加10mol/L盐酸50μl，室温下200r/min振荡10min，弃去盐酸，用去离子水冲洗5次后甩干。每孔加50mmol/L乙酸钠(pH4.0)150μl，室温下200r/min振荡5min，弃去，重复3～4次。

　　1.2.4 芯片点样及检测 在弱阳离子交换芯片点上述稀释血清样品60μl，置振荡器上4℃ 100r/min振荡60min后弃去液体，用150μl 50mmol/LHEPES(pH7.0)冲洗3次，每次振荡5min,最后一次用1mmol/LHEPES(pH7.0)快速冲洗，风干。在SPA中加入75μl乙腈和75μl 1%三氟乙酸，充分振荡(5～10)min，确保SPA全部溶解，离心1min。芯片上每孔加SPA1μl，风干后每孔再加SPA 1μl风干。用All-In-One标准蛋白质NP20芯片校正SELDI飞行质谱仪，设定仪器参数，在Ciphergen ProteinChip软件中设定芯片阅读程序，以读取芯片数据。蛋白质芯片阅读机以每秒10HZ的速度从所获得的原始数据精确地绘制蛋白质图谱。结合SPA后的蛋白质在激光的轰击下解离，带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比(M/Z)的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比与离子飞行时间的平方成正比。公式为：E=UZ=1/2mv2，t=L/V推出M/Z=Kt2=2Ut2/L2,Z为离子所带电荷数，U为电压，L为加速飞行电场电压，v为飞行速度，K为常数。

　　1.3 统计学分析 用Ciphergen ProteinChip软件对分组数据及相关性进行分析，用BioMarker Wizard软件分析不同组在相同质荷比的蛋白质含量的表达强度，两组间比较使用t检验。

　　2 结果

　　2.1 差异蛋白质点的获取 应用弱阳离子交换芯片在未经及经介入治疗的肝癌患者血清中检测到在不同质荷比处有3个差异蛋白质峰(图1)，经统计学分析蛋白质含量差异有统计学意义(表1)。

　　2.2 肝癌介入相关性蛋白质的数据查询结果 分别对这3个蛋白质峰进行数据库搜索，得到3种与之分子量最为接近的蛋白质(表2)。表1 应用WCX2芯片三组在不同质荷比处3个差异蛋白质的相对含量(略)*：与未经治疗的肝癌患者比较，P<0.05表2 3个差异蛋白的数据库搜索结果(略)。

　　3 讨论

　　肝癌是全球癌症相关性死亡的主要原因之一，很多患者在治疗时已属晚期，丧失了手术机会。近年来介入治疗迅速，已被公认为肝癌的非手术治疗的首选方法。经肝动脉介入治疗的效果令人满意，而寻找介入治疗的药物靶点尤其显得重要[5]。肿瘤的发生、发展过程中有多种蛋白质发生变化，导致肿瘤的蛋白质谱发生改变。利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤，为肿瘤的治疗提供指导。蛋白质组(Proteome)是1994年由澳大利亚学者Marc Willkins和Keith Williams率先提出的，是指一个基因组、一个细胞或一个组织所表达的全部蛋白质及其活动的方式。而蛋白质组学(Proteomics)则是在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动[6]。经典的蛋白质组学研究技术是双向凝胶电泳联合质谱的方法，但双向电泳具有一定局限性，如操作复杂、重复性差、分辨率低等[7]。蛋白质芯片是近些年发展起来的蛋白质组学新技术，可以从微量样品中检测成千上万个蛋白质或多肽，用于差异表达的蛋白质及药物靶标的筛选和鉴定[8，9]。SELDI蛋白质芯片技术利用具有不同化学或生物表面修饰的芯片，选择性富集蛋白质，在添加能量吸收分子后送入蛋白质芯片阅读机，以SELDI飞行时间质谱检测被富集的所有蛋白质[10]。SELDI蛋白质芯片检测灵敏度高，可检测传统方法检测不到的蛋白质和多肽，并可直接检测不经处理的血清、尿液等体液和分泌物，同时获得样品中目标蛋白质的分子量、等电点、糖基化位点等多个参数。目前SELDI蛋白质芯片技术应用最多的是在筛选和确定药物靶点方面。Petricoin等[11]已用SELDI蛋白质芯片从血清中筛选卵巢癌的特异性药物靶点，Adam等[12]则从血清中筛选出诊断前列腺癌的特异性药物靶点。本研究应用弱阳离子交换芯片和SELDI飞行时间质谱仪快速、有效地分析了介入治疗对肝癌患者血清中蛋白质含量的影响，检测到3个明显变化的差异蛋白质峰，分别为小诱导细胞因子A15前体、线粒体铰链蛋白、Actin相关蛋白，提示这3个蛋白质很可能是对肝癌介入治疗极为敏感的靶分子，有望成为肝癌治疗的新的药物靶点。

【】
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　　[2]Paradis V, Degos F, Dargere D, et al. Identification of a new marker of hepatocellular carcinoma by serum protein profiling of patients with chronic liver disease[J].Hepatology, 2005,41∶40-47.

　　[3]Roelofsen H, Balgobind R, Vonk RJ. Proteomic analyzes of copper metabolism in an in vitro model of Wilson disease using surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry[J].J Cell Biochem, 2004, 93∶732-740.

　　[4]汤钊猷.肿瘤学[M].上海：上海医科大学出版社，1993∶561.

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　　[6]李悦国，张维铭.蛋白质组学在肝癌及其相关疾病研究中的应用[J].肿瘤临床，2005，32∶957-960.

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　　[11]Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer[J].Lancet, 2002, 359∶572.

　　[12]Adam BL, Qu Y, Davis JW, et al. Serum protein fingerprinting coupled with a pattern-matching algorithm distinguishes prostate cancer from algorithm distinguishes prostate cancer from benign prostate hyperplasia and healthy men[J].Cancer Res, 2002, 62∶3609.