PD-1及其配体在慢性乙肝免疫中的作用
【关键词】 乙肝 免疫
HBV特异性T淋巴细胞功能低下与HBV逃避免疫是造成HBV慢性持续感染的原因，T淋巴细胞功能状态决定了病毒是被清除，或是持续感染。T淋巴细胞异常表达某些免疫分子与慢性乙肝(CHB)的发生、过程有关。PD-1为近年发现的CD28家族新成员，因其独特的生物学功能而备受关注，已发现其在慢性乙肝免疫应答过程中发挥重要作用，但其具体免疫机制尚需进一步研究[1]。
1 PD-1的生物学特性
PD-1最初从T细胞杂交瘤2B4.11中克隆得到，认为与细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡分子。人PD-1基因定位于2q37，编码分子量约为50 000的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，其胞外端为IgV样结构域，此结构可能在与配体的结合中起重要作用。PD-1分子的显著特点是其胞浆区尾部含有2个酪氨酸残基，N端酪氨酸残基参与构成免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，C端酪氨酸残基则参与构成免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，因此PD-1可介导负性信号。但介导负性信号并不是由N端ITIM而是C端ITAM通过招募SHP-2而实现[2]。其他CD28家族成员都以同源二聚体形式存在，而PD-1以单体形式存在，因其缺乏保守的半胱氨酸。PD-1主要诱导表达于活化的T细胞、B细胞、单核细胞和髓样细胞，但CD4-CD8-胸腺细胞和不成熟的B细胞可组成性表达PD-1。目前的研究表明，PD-1介导抑制信号[3]。
2 PD-Ls及其信号转导通路
2.1 PD-L1与PD-L2 PD-L1是首先发现的PD-1配体，经同源筛选从胎盘的cDNA文库中获得其cDNA[4]。人的PD-L1基因定位在染色体9q24.2，编码290个氨基酸残基的I型跨膜蛋白，属B7家族成员。人成熟的PD-L1包含有IgV样结构域、IgC样结构域、疏水性跨膜区及胞浆区尾部。胞外区4个保守半胱氨酸残基是Ig样结构中二硫键形成的基础。胞内段一潜在的PKC磷酸化位点可能是信号转导的结构基础。PD-L1广泛地组成性表达于非淋巴组织内如肝脏、胎盘、心脏和骨骼肌，也可诱导表达于活化的B淋巴细胞、T淋巴细胞及树突状细胞上。这种分布形式提示，PD-1介导非淋巴组织内淋巴细胞应答[3,4]。PD-L2是继PD-L1后发现的PD-1又一配体，人的PD-L2同样定位于人9p24.2，与PD-L1转录方向相同,两者仅间隔4.2 kb。PD-L2基因编码含247个氨基酸残基相对分子量约为25 000的蛋白[1]。PD-L2和PD-L1有明显的同源性即34%相同性和48%相似性。IFN-Y可诱导PD-Ll表达上调，而PD-L2却在IL-4和IL-13的诱导下表达。PD-L2分布相对较局限，主要表达于单核细胞并在DC上呈选择性表达[3,5]。
2.2 PD-1/PD-LS信号通路 PD-LS/PD-1信号在免疫反应的起始部位和实质器官部位双重抑制T、B淋巴细胞的活化，对维持机体的外周耐受发挥着重要的作用[6]。研究发现，T淋巴细胞表面PD-1和TCR发生配基化后，可抑制Ca2+内流并通过PD-1胞浆区C端ITAM招募SH2酪氨酸磷酸酶-2(SHP-2)，使下游信号分子SyK、磷脂酶-3、磷脂酰肌醇-3激酶和胞外区信号调节激酶等脱磷酸化而失活[6，7]。外源性IL-2能够逆转PD-1的抑制作用，使其恢复结合被抑制的T淋巴细胞的能力,提示被抑制的T细胞保留有对IL-2反应的能力，但CD8 T细胞因其不能产生高水平的IL-2而反应能力相对低下[3，6]。虽然大量研究提示PD-1/PD-LS提供抑制信号，然而,有关该通路的生物学功能仍存争议。一些研究发现，PD-L1和PD-L2似乎为T细胞提供了活化信号。例如有学者发现在PD-L1和低水平anti-CD3刺激下，T细胞并没有增殖低下反而增殖增强并分泌IL-10增加 ;PD-L2协同刺激T细胞增殖甚至比B7-1更有效，而且PD-L2可为分离的幼稚T细胞产生IFN-Y提供正性信号[8]。另外，Julia等[9]利用BALB/c小鼠模型研究PD-LS通路时发现，DC上PD-L1和PD-L2都高表达，用PD-L1 Ig和PD-L2 Ig分别封闭PD-L1和PD-L2,都能促进T淋巴细胞的增殖与IFN-Y分泌。可能是模型种属和技术的差异导致了不同的结果，但也不能排除PD-LS存在第二受体并协同刺激T细胞增殖的可能。
3 PD-1信号与CHB特异性免疫应答
在HBV慢性感染过程中，机体特异性的免疫功能低下,病毒逃避机体免疫导致慢性持续感染。CD8 T淋巴细胞的数量和功能状态决定着机体的免疫状态。大量研究表明，CHB感染者抗原特异性的T淋巴细胞功能低下，其抗病毒效应要明显低于急性感染者。众所周知，T细胞的活化需要双重信号：第一信号是APC递呈的MHC限制性抗原肽与T细胞表面TCR-CD3复合体交联所产生;第二信号是由APC表面共刺激分子与T细胞表面相应受体结合所提供的。机体的免疫应答需要正性和负性信号的协同来维持其平衡，其中PD-1/PD-LS提供的负向信号是迄今认为与慢性病毒感染关系最为密切，且是很有前景的靶位。当PD-1与PD-LS结合后，可通过阻断正信号分子CD28激活介导的PI3K途径而抑制T细胞的增殖和分化[6]。研究发现，慢性HCV患者外周血抗原特异性T淋巴细胞PD-1表达水平较正常对照和急性感染者明显增高，PD-1水平与T细胞功能“耗竭”以及病毒的持续复制密切相关[7] 。另外，有报道称在HIV感染者体内也发现了PD-1在抗原特异性T淋巴细胞上过表达[3，7]，同时发现HBV特异性的T淋巴细胞PD-1高表达也与CHB有着密切关系。在研究T淋巴细胞表面PD-1与CHB的关系时，有学者[10]报道，健康对照组CD4 及CD8 T淋巴细胞PD-l的阳性表达率分别为(5.92±1.75)%和(5.98±0.88)%，而CHB患者分别为(17.76±2.47)%和(11.92±2.21)%。CHB患者PD-l在T淋巴细胞的表达水平明显高于健康对照组，且其表达水平与ALT水平及HBV DNA载量呈明显正相关。还有学者发现CHB患者mDC表面PD-L1明显过表达，进一步在体外利用PD-1 Ig阻断PD-1/PD-L1的通路，发现外周血特异性T淋巴细胞显著增加，mDC分泌IL-12增加但IL-10减少[11]。 Xie等[12]也指出利用可溶性受体sPD-1封闭PD-1，阻断PD-1/PD-LS信号，致外周T淋巴细胞的数量显著增加。目前认为与HBV特异性T淋巴细胞PD-1结合的配体主要是PD-L1。在HBV转基因小鼠体内，Holly等[8]用PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1通路后，IFN-Y分泌抑制延迟，且INF-Y诱导的特异性CTL细胞数量增加,故认为PD-L1是PD-1在肝内最可能的配体。Chen等[11]指出慢性HBV感染使mDC上PD-L1而不是PD-L2高表达，从而导致T细胞功能缺陷及数量低下。另外，Peng等[1]发现,CHB患者PBMC上PD-1和PD-L1表达都增加，PD-L1在CHB患者(尤其是HBeAg阳性CHB患者)PBMCs中的表达水平较AHB患者和健康对照组显著增高;与此相反，在AHB患者和正常对照者PBMCs上PD-L2仅有少量表达且无组间差异。以往的研究也表明是PD-L1而不是PD-L2导致外周组织T细胞耐受[13]。Natalia[14]发现PD-L1是外周CD8 T细胞耐受所必需，而PD-L2引起CD4 T细胞耐受，但CHB患者主要是HBV特异性的CD8 T细胞功能缺陷。但也有学者发现在慢性丙肝患者体内HCV特异性CD8 T细胞上PD-1表达上调，在体外，PD-1/PD-LS信号可使HCV特异性T淋巴细胞增值和分泌IFN-Y增多[7]。上述结果不同主要是其它淋巴器官中的PD-1及PD-LS的表达情况尚未检测，不能完全否定PD-Ls在这些器官的高表达及PD-1/PD-LS途径可能存在的正向效应。配体信号PD-L1究竟是由哪类细胞提供目前还存在不同的看法。Chen等[11]在分析CHB与DC功能关系的机制时发现CHB患者外周mDC高表达PD-L1;在体外，IFN-Y能显著刺激mDC分泌IL-12且能使其促进T细胞产生IFN-Y。与健康来源的mDC相比，正常T细胞对来自CHB患者的mDC反应更低，提示mDC本身有内在功能缺陷。认为CHB患者T细胞功能低下是由于mDC上PD-L1增多致内在缺陷，从而使其促T淋巴细胞活化的能力下降并导致T淋巴细胞数量减少。但有学者认为肝细胞本身组成性表达低水平的PD-L1，当受到病毒感染，活化T细胞和干扰素诱导时肝细胞表达PD-L1显著增加，并诱导T细胞凋亡[15]。新近的研究却发现，CHB患者PBMC上PD-L1表达量与AHB患者和健康对照者比较有显著统计学差异，并且在体外，HBV抗原刺激PBMC后可观察到HBV特异性T淋巴细胞增值，阻断PD-1/PD-L1通路显著提高T细胞增值和IFN-Y分泌[1]; Geng等[16]也证实CHB患者体内PBMC PD-L1水平较急性乙肝及健康对照者高，且PD-L1水平与ALT负相关;Xie等[12]的研究结果与Geng相似，但认为PD-L1水平与ALT成正相关。也有少数学者认为肝非实质细胞包括肝窦内皮细胞和肝库否细胞组成性表达PD-L1抑制T细胞增殖,是肝免疫的负性调节者，封闭PD-1/PD-L1通路可增强抗病毒免疫[17，18]。以上结果表明，上述细胞都起了专职或非专职抗原提呈细胞的作用，但究竟是哪类细胞起主导作用还有待进一步研究。至于T淋巴细胞表面PD-1与血转氨酶水平及病毒载量的关系，不同的实验得出不一致的结果,可能是因为肝脏作为HBV感染的靶器官，血浆病毒载量并不能确切反映肝内病毒的复制状况，另外由于长期用药等其他因素,血浆转氨酶水平也不能真实反映肝脏损伤状况，同时也可能对PD-1及PD-LS的表达产生影响。以上这些结果提示在HBV慢性感染过程中，长期的HBV抗原刺激可能诱导了病毒特异性T细胞上PD-1的表达上调，通过与同样被诱导高表达的配体形成抑制性信号阻断机体特异性的免疫应答，从而导致病毒的长期复制和持续感染。
4 展望
目前研究表明PD-1/PD-LS是一对主要的负性免疫分子，与慢性病毒感染密切相关。但有关PD-1/PD-LS的生物学功能及其在CHB感染中的机制还不是很明确。探讨PD-1/PD-LS的免疫机制有助于阐明CHB发病机制及为其提供新的方法。
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