地塞米松对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠的保护作用
【摘要】 目的通过地塞米松对脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）诱导的大鼠急性肺损伤时炎症介质的影响作用，探讨其对肺脏的保护机制。方法 健康雄性S-D大鼠随机分成A、B、C、D组，各组分别按1、2、4h三个时间点再设立3个亚组。A组经腹腔注射地塞米松;B组经腹腔注射LPS，C组在腹腔注射LPS前1h经腹腔注射地塞米松，D组为对照组。在到达各时间点后，经腹腔注射加倍剂量的硫喷妥钠处死，切开气管，并予0℃0.9%氯化钠注射液（normal saline，NS）作肺泡灌洗。采用酶联吸附免疫法（ELISA）测定肺泡灌洗液（broncho alveokar lavage fluid，BALF）中的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（iaterlrukin-Iβ，IL-1β）与巨噬细胞炎性蛋白-2（macrophafe inflamnatovy protein-2，MIP-2）。另外12只大鼠按上述分组法随机分成4组，每组3只，动物模型同上，作肺组织病理观察。结果在病理形态学上与D组比较，B组肺损伤严重。BALF中TNF-α、IL-1β、MIP-2在A、B、C、D组间比较差异均有统计学意义（F分别=15.51、47.37、19.94、134.27、65.44、57.29、18.44、85.31、89.13，P均<0.05）。B组与D组比较，TNF-α差异有统计学意义（t分别=5.37、8.69、6.43，P均<0.05）、IL-1β差异有统计学意义（t分别=7.25、9.77、11.51，P均<0.05）、MIP-2差异有统计学意义（t分别=6.84、12.38、15.52，P均<0.05）;C组与D组比较，TNF-α差异有统计学意义（t值分别为2.43、2.67、1.98，P均<0.05）、IL-1β差异有统计学意义（t分别=3.58、4.15、4.81，P均<0.05）、MIP-2差异有统计学意义（t分别=1.87、3.73、7.55，P均<0.05）;C组与B组比较，TNF-α差异有统计学意（t分别=3.15、4.19、4.03，P均<0.05）、IL-1β差异有统计学意（t分别=3.71、5.27、5.81，P均<0.05）、MIP-2差异有统计学意义（t分别=4.33、6.89、7.14，P均<0.05）。
结论地塞米松可降低炎症介质水平，提示对肺脏具有保护作用。
【关键词】 地塞米松 脂多糖 肺损伤 炎症介质
【Abstract】 Objective To study the protective effects of dexamethasone on lipopolysaccharide（LPS）-induced lung injury in rats.Methods SeventytwoS-Dratswererandomlydividedinto4groups（groupA，B，C，D），andeachgroup dividedinto3subgroups at1，2and4hours.GroupDwas control，groupAreceivedDEX（1mg/kg）byintraperitoneallyin-jection，groupBreceivedLPS（5mg/kg）byintraperitoneallyinjection，andgroupCreceivedDEX1hourbeforeLPSbyin-traperitoneally injection.All the animalswere killedwithoverdose of sodiumpentathol at1，2and4hours respectively.The bronchoalveolarlavage（BAL）wasperformedthroughatrachealcannulawith8mlice-salineeachrat，andthewithdrawalrate ofbronchoalveolarlavagefluid（BALF）wasmorethan70%.The concentrationoftumornecrosisfactor-α（TNF-α），in-terleukin-1β（IL-1β），andmacrophageinflammatoryprotein-2（MIP-2）weremonitoredinBALFbyELISA.Another12ratswererandomlydividedinto4groups，3ratsineachgroupforhistologicalstudy.Results Lunginjurywasseriousingroup BcomparedwithgroupD.Therewerenosignificantdifferences inthe concentrationofTNF-α，IL-1βandMIP-2between groupAandD（P>0.05）.TheseparametersweresignificantlyhigheringroupBandCthanthatofgroupAandD（P<0.05），andincreasedmoresignificantlyingroupB（P<0.05）.The concentrationofIL-1βandMIP-2wereincreasingasthetime elongation，andpeaked at4hours;TNF-αpeaked at2hours inthesetwogroups.IL-1β，MIP-2andTNF-αwere sig-nificantlyloweringroupCthanthatofgroupB（P<0.05）.Conclusion DexamethasonecouldprotectLPS-inducedlung injurythroughinhibitinflammatorymediators.
【Keywords】dexamethasone;lipopolysacchride;lunginjury;inflammatorymediators
致其发生。目前，ALI的发病机制尚未完全阐明，但普遍认为，炎症介质的大量产生和释放以及中性粒细胞的激活是其重要的发病机制 ［1，2］ 。巨噬细胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）均为反映早期炎症反应的产物。地塞米松具有明显的抗炎作用，但在临床上应用于ALI则一直存在争议。本次研究采用脂多糖诱导的大鼠ALI模型，研究在给予地塞米松后肺泡灌洗液（broncho alveolar lavage fluid，BALF）中的炎症介质变化及其对肺脏的保护作用。
1材料与方法
1.1 材料 健康雄性S-D大鼠72只，体重195～270g，平均（231±38）g（由浙江医学院提供）。采用随机排列表法分成4组，即地塞米松组（A组）、脂多糖（lipopolsacc ahride，LPS）组（B组）、LPS+地塞米松（C组）和对照组（D组），上述各组分别按1、2、4h时间点再设立3个亚组（共12个亚组），每亚组大鼠数为5只。另外12只大鼠按上述分组法随机分成4组，每组3只，均为4h时间点，作肺组织病理观察。
1.2模型制作及取材动物模型制作参照 ［3，4］ 。采用硫喷妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉。A组在予以无菌0.9%氯化钠注射液（normal saline，NS）0.5ml腹腔注射1h后，再重复一次;B组在腹腔注射NS0.5ml前1h经腹腔注射地塞米松1mg/kg（由浙江仙居制药股份有限公司生产，批号030507）;C组在腹腔注射脂多糖5mg/kg（LPS，美国Sigma公司，Eschrichia coli055:B5，L2880）前1h经腹腔注射NS0.5ml;D组在腹腔注射LPS前1h经腹腔注射地塞米松1mg/kg。所有动物在到达各实验时间点后，均经腹腔注射加倍剂量的硫喷妥钠处死。行气管切开术，插入自制14G血管留置导管，深度约1cm，缝线结扎固定以防BALF溢出。经导 管缓慢注入无菌冰NS8ml，并回抽，反复进行5次（最后将动物置于头低足高位），BALF回收率>70%。BALF在4℃、2000rpm条件下离心10min后，取其上清液，放入冻存管内，并于-80℃下保存备用。
1.3观察指标
1.3.1病理观察组的动物模型制作除不做肺泡灌洗外，余步骤同上。经胸骨正中行剖胸术，取出肺脏浸泡于10%福尔马林液中保存。分离肺叶，作矢状切开，石蜡包埋，制成5μm厚的病理切片标本，并予HE染色。
1.3.2 采用酶联吸附免疫法（ELISA）测定BALF中的MIP-2、TNF-α、IL-1β。检测方法按说明书操作。抗鼠MIP-2（由美国Market公司生产）、抗TNF-α、IL-1β抗体（由美国Lifekey BioMeditech公司生产）、Bio-Rad读数仪（由日本Bio-Rad公司生产，型号550）。
1.4统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包进行处理与分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较以方差分析和Dunnett法检验。设P<0.05差异有统计学意义。
2结果
2.1病理结果 A组肺泡腔清晰，结构完整，肺泡隔均匀一致，壁光滑，可见少量白细胞，肺泡腔内无渗出液;B组肺组织毛细血管明显扩张、充血，白细胞附壁，肺泡隔明显增厚，大量白细胞渗出、聚集，肺泡腔中可见渗出液和漏出聚集的红细胞，大片肺泡腔萎陷不张;C组肺泡隔增厚，部分肺泡萎陷不张，白细胞渗出及聚集较脂多糖组减少;D组肺组织形态学与A组相似。
2.2四组BALF中MIP-2、TNF-α、IL-1β的浓度变化见表1由表1可见，BALF中TNF-α、IL-1β、MIP-2在A、B、C、D组间比较差异均有统计学意义（F分别=15.51、47.37、19.94、134.27、65.44、57.29、18.44、85.31、89.13，P均<0.05）。B组与D组比较，TNF-α差异有统计学意义（t分别=5.37、8.69、6.43，P均<0.05）、IL-1β差异有统计学意义（t分别=7.25、9.77、11.51，P均<0.05）、MIP-2差异有统计学意义（t分别=6.84、12.38、15.52，P均<0.05）;C组与D组比较，TNF-α差异有统计学意义（t值分别为2.43、2.67、1.98，P均<0.05）、IL-1β差异有统计学意义（t分别=3.58、4.15、4.81，P均<0.05）、MIP-2差异有统计学意义（t分别=1.87、3.73、7.55，P均<0.05）;C组与B组比较，TNF-α差异有统计学意（t分别=3.15、4.19、4.03，P均<0.05）、IL-1β差异有统计学意（t分别=3.71、5.27、5.81，P均<0.05）、MIP-2差异有统计学意义（t分别=4.33、6.89、7.14，P均<0.05）。
3讨论
ALI是一种临床各科常见的危重综合征，几十年来死亡率一直居高不下，也是一个困扰临床医生多年的棘手问题。严重阶段的ALI称为急性呼吸窘迫综合征。目前，对ALI的发病机制仍未完全明了，许多研究认为炎症介质的大量产生和释放，以及中性粒细胞的激活是导致ALI发生的重要机制 ［1，2］ 。在本项研究中，大鼠腹腔内注射LPS5mg/kg4h后，出现明显的肺损伤病理形态学改变，BALF中TNF-α、IL-1β和MIP-2较对照组也明显升高，表明成功建立了ALI模型 ［3］ 。
炎症介质既是炎性细胞信号转导的下游产物，也可以成为激活炎性细胞信号转导的上游刺激物 ［4，5］ 。例如，炎症介质可激活转录因子核因子-κB（nuclear fac-tor-κB，NF-κB），而激活后的NF-κB又可以诱导众多炎症介质基因的表达，从而使炎症信号进一步放大 ［6］ 。在临床上，感染往往是导致ALI发生的重要诱因，而LPS作为G-细菌细胞壁的主要成分，也是其主要的致病因素。本次研究结果显示，LPS诱导大鼠ALI时，在BALF中，炎症介质TNF-α、IL-1β和MIP-2等明显升高。由于这几种炎症介质均为炎症反应早期产物，表明炎症介质在LPS诱导的大鼠ALI时起了重要的作用。其中MIP-2为一种α-化学趋化因子，其作用在于吸引中性粒细胞粘附于血管壁，并进入到肺间质，而中性粒细胞激活后可释放出溶酶体酶及大量的氧反应产物。动物实验及临床研究均证实ALI时BALF中炎症介质水平明显升高，而抑制炎症介质可使肺损伤程度减轻 ［7，8］ 。
糖皮质激素在ALI中的作用一直存在很大的争议，认为其抗炎作用确切，但由于可能诱发或加重感染而限制了在临床上的应用。许多临床研究发现给予ALI患者糖皮质激素后并不能降低死亡率 ［9］ 。但Meduri等 ［10］ 认为严重感染时，过量的炎症介质可激活某些重要的转录因子（如NF-κB），使之与糖皮质激素受体结合，影响了与内源性糖皮质激素的结合，而丧失调节免疫系统的作用，产生所谓的“极度饥饿”状态。因而提出“长程激素疗法”，即使用长时间足量的外源性糖皮质激素后，会抑制炎症介质的表达，从而恢复糖皮质激素受体的功能，并提示有可能降低ALI 患者的死亡率。目前，认为糖皮质激素在治疗ALI中的作用机制主要是通过阻止NF-κB抑制蛋白（inhibitor ofNF-κB）的降解，从而抑制NF-κB活化及其对炎症介质基因的转录作用。本次研究结果发现，在给予大鼠LPS前1h予大剂量的地塞米松，可减轻肺病理形态学损害，并显著降低BALF中TNF-α、IL-1β和MIP-2水平，结果表明大剂量地塞米松可通过抑制炎症介质的产生而对肺脏具有保护作用。
【】
1 Kang JL，Lee HW，Lee HS，et al.Time course for inhibition oflipopolysaccharide-induced lung injury bygenistein:relation-ship to alteration in nuclear factor-kappaB activity and inflam- matoryagents［J］.CritCareMed，2003，319（2）:517-527.
2Parsons PE.Mediators andmechanismsofacute lunginjury［J］.ClinChestMed，2000，21（2）:467-474.
3BlackwellTS，BlackwellTR，HoldenEP，etal.Invivoantioxidanttreatment suppressesnuclearfactor-kappaB activationandneu-trophiliclunginfammation［J］.JImmunol，1996，157（4）:1630-1639.
4BaetzD，ShawJ，KirshenbaumLA.Nuclearfactor-kappaBdecoys suppress endotoxin-induced lunginjury［J］.MolPharmacol， 2005，67（2）:977-1006.
5 Wesierska-GadekJ，GoetzAE.RoleofPARP oniNOSpathway duringendotoxin-inducedacutelunginjury［J］.IntensiveCareMed，2004，30（11）:1421-1432.
6SuX，WangL，SongY，etal.Inhibitionofinflammatoryresponsesby ambroxol，a mucolytic agent，in a murine model of acute lung injury induced by lipopolysaccharide［J］.Intensive CareMed， 2004，30（1）:133-139.
7OttonelloL，ArduinoN，Bertolotto M，etal.Invitroinhibitionofhumanneutrophilhistotoxicitybyambroxol:evidenceforamulti- stepmechanism［J］.BrJPharmacol，2003，140（2）:736-745.
8LiuSF，YeX，MalikAB.InhibitionofNF-kappaBactivationbypyrrolidine dithiocarbamateprevents invivoexpression of proin- flammatorygenes［J］.Circulation，1999，100（3）:1330-1337.
9DoyleRL，SzaflarskiN，ModinGW，etal.Identificationofpatients with acute lung injury:predictors ofmortality［J］.AmJ Respir CritCareMed，1995，152（5）:1818-1826.
10Eduri GU，TolleyEA，ChrousosGP，etal.Prolongedmethypred-nisonlonetreatmentsuppresses systemic inflammationinpatients withunresolvingacuterespiratorydistresssyndrome:Evidenceforinadequateendodogenousglucocorticoidsecretion and inflamma- tion-inducedimmunecellresistancetoglucocorticoids［J］.AmJ RespirCritCareMed，2002，165（2）:983-991.
