谈奥扎格雷钠对缺血再灌注大鼠脑海马区细胞保护作用的研究

　　[关键词] 奥扎格雷钠　脑缺血/再灌注　IL-6　TNF-α

　　[论文摘要] 目的  观察奥扎格雷钠对大鼠脑缺血/再灌注后IL-6和TNF-α蛋白表达的影响并探讨其作用机制。方法  将30只SD雄性大鼠随机分为正常组、缺血/再灌组和奥扎格雷钠组。采用大鼠大脑中动脉线栓(MCAO) 法制备局灶性脑缺血/ 再灌注模型, 应用免疫组化法分别检测各组大鼠脑组织IL-6和TNF-α蛋白表达。结果  与正常组比，脑缺血/再灌注组IL-6和TNF-α蛋白的表达明显增多( P < 0.05)；奥扎格雷钠能明显减少TNF-α的表达( P < 0.05)，而对IL-6表达无影响( P > 0.05)。结论: 奥扎格雷钠对大鼠脑缺血/ 再灌注具有保护作用，其机制可能与抑制TNF-α表达有关。

　　[Key words] Iinterleukin- 6 (IL-6);tumo rnecrotic factor alpha (TNF-α),ischemia-reperfusion; Ozagrel sodium

　　[Abstract] Objective  Observe the effect of Ozagrel sodium on levels of IL-2 and TNF-a in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury , and study the mechanisms of protective effect s of Ozagrel sodium against focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods  rat s were randomly divided into three groups. normal group, ischemia- reperfusion group and Ozagrel sodium group,Ozagrel sodiumwas injected at 30 min before ischemia. The right middle cerebral artery of the rat was occluded by inserting a thread through internal carotid artery for 2h , and then reperfused for 12h. Results  The levels of IL-6and TNF-a were significantly increased in the brain tissue of ischemia-reperfusion group compared with normal group; While compared with ischemia-reperfusion group , The levels of TNF-a was significantly decreased in the Ozagrel sodium group. Conclusion  Ozagrel sodium can reduce ischemia-reperfusion injury by decreasing the damage to the TNF-a.

　　随着中枢神经系统（central nervous system CNS）疾病的发病率逐年提高，其已经成为影响人们生活质量、威胁人类生命的主要疾病之一。奥扎格雷钠(Ozagrel sodium ) 是目前广泛应用于临床脑血管病的药物之一, 但其具体作用机制报道很少[1]。IL-6和TNF-α是人体内具有多种生物学活性的细胞因子，广泛的参与机体多种生理机制的调节。近年来研究发现，在中枢神经系统缺血性损伤后，IL-6和TNF-α是在脑组织损伤和修复过程中起着重要作用的前炎性细胞因子。奥扎格雷钠是否通过影响IL-6和TNF-α的表达实现作用, 尚未见到实验研究报道。本实验通过光镜和免疫组化方法来探讨奥扎格雷钠的脑保护作用, 为其治疗脑血管病提供更深层次理论依据。

　　1．材料与方法

　　1.1动物分组

　　30只300～350g健康成年Wister雄性大鼠，随机分成对照组、缺血再灌注组和奥扎格雷钠组，每组10只，其中奥扎格雷钠组再灌注前30分钟舌静脉8 mg/kg注射奥扎格雷钠。

　　1.2模型制备

　　采用大鼠大脑中动脉线栓(MCAO)法制备动物模型[2]：用6%水合氯醛 ( 0.4～0.5ml/100g)腹膜腔内注射麻醉,颈部正中切口,暴露颈总动脉在其深面穿一细线,钝性分离颈内、外动脉。在颈外动脉上剪一小口，用制备的插线 (在插线 20mm处做一标记 )插入颈外动脉至颈总动脉,将颈外动脉拉向下方,使其与颈内动脉成直线,将插线经颈总动脉分叉处插入颈内动脉。插线入颅后,一方面注意插入长度,另一方面应注意手感,当遇到阻力时应立即停止,以免用力过大插破血管。然后收紧颈外动脉根部线的活结 ,松开颈总动脉夹,观察有无出血,抽出颈总动脉深面的细线。连续缝合手术切口,注意动物保暖,待其清醒后观察其行为和症状。栓塞2小时后进行再灌注，再灌注时间为12小时。

　　1.3海马区脑组织检测

　　HE染色观察组织坏死情况。免疫组织化学染色检测组织IL-6和TNF-α蛋白含量变化。光学显微镜下，采用BI-2000医学图像分析系统对免疫组织化学切片结果进行观测，对于IL-6免疫阳性细胞和TNF-α免疫阳性细胞的形态学观测时以400倍光镜下所见形态为准；而对于免疫阳性细胞数量的统计，采用400倍光镜下每张切片选取5个最高密度区，对免疫阳性细胞的数目进行计数。采用SPSS10.0进行统计学分析，在进行多组间比较时采用q检验，两组比较时才用t检验，检验水准α=0.05
　　2.结果：

　　2.1HE染色结果

　　光学显微镜观察可见，1.  正常组海马区神经胶质细胞及毛细血管形态正常，结构完整，核仁清晰，胞浆无红染。海马区锥体细胞排列整齐，高倍镜下可见锥体细胞核大而圆、核仁明显（图1）。2.  脑缺血再灌注组海马区神经胶质水肿加重，海马锥体细胞排列散乱，胶质细胞稀疏变性，海马区锥体细胞出现异常变化，细胞体积缩小，核不规则，大量变性，变性的锥体细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红（图2）。3.治疗组海马区锥体细胞层结构基本正，但神经元周围间隙扩大、胶质轻度水肿，可见血管周围炎性细胞浸润（图3）

    图1正常组海马区组织400× 图2模型组海马区组织400× 图3治疗组海马区组织400×

　　2.2海马区IL-6和TNF-α免疫组织化学观测结果

    免疫组织化学染色（见图4-9）实验结果经统计学分析处理显示，正常组海马区IL-6免疫阳性细胞有少量表达，主要分布于皮质内，而髓质内少见或未见。模型组IL-6免疫阳性细胞表达数量明显增多，在脑组织缺血损伤和坏死区呈密集分布，向周围逐渐减少，髓质表达相对增多,与正常组差异性显著（P<0.05）。给与奥扎格雷钠治疗后IL-6的表达变化不明显，与模型组之间无统计学差异（P>0.05）（见表1）；同时检测到正常组大鼠海马区TNF-α免疫阳性细胞有少量表达，而模型组大鼠海马区TNF-α免疫阳性细胞表达数明显增多，与正常组之间有显著性差异（P<0.05）。经过奥扎格雷钠治疗后表达迅速降低，逐渐趋于正常（P<0.05）（见表1）。

    图4正常组IL-6免疫组化100×       图5模型组IL-6免疫组化100×      图6治疗组IL-6免疫组化100×

　　图7正常组TNF-α免疫组化100×    图8模型组TNF-α免疫组化100×    图9组TNF-α免疫组化100×

表1各组大鼠心肌细胞IL-6和TNF-α免疫组化阳性细胞数（ ±s）

　　注：与对照组比较*P<0.05；与模型组比较△P<0.05    

　　讨论

　　奥扎格雷钠是一种选择性的血栓烷2A2 ( TXA2 ) 合成酶抑制剂，广泛应用于临床对脑血管疾病的治疗。本实验显示,明显减轻缺血脑组织的损伤程度,其保护作用机制可能与其对IL-6和TNF-α表达的调节有关。
　　TNF-α作为细胞因子中的重要成员，在脑组织的缺血性损伤的发生、过程中起着重要的作用。在中枢神经系统内，TNF-α主要来源于小胶质细胞、星性胶质细胞、神经元细胞、血管内皮细胞和侵入的白细胞分泌TNF-α，但正常状态下表达较低[3]。脑缺血/再灌注后，上述细胞分泌TNF-α的表达明显增加，导致脑组织的缺血性损伤，且TNF-α的表达与脑组织的损伤程度呈正相关,通过研究发现，对脑缺血动物模型预先给予TNF-α抗体，可显著降低脑缺血/再灌注损伤，本试验中模型组TNF-α变化与上述相符，给与奥扎格雷钠治疗后TNF-α表达明显下降，说明奥扎格雷钠在脑组织缺血再灌注中能够抑制TNF-α的表达，减轻对脑组织的损伤[4-5]。

　　而奥扎格雷钠治疗前后，海马区IL-6的含量无明显变化，说明奥扎格雷钠对脑组织的保护不是通过调节IL-6起作用的。在脑缺血/再灌注过程中，TNF-α除作为炎性因子直接诱发脑组织的缺血性损伤坏死外，还可作为IL-6的刺激因素引起IL-6的合成分泌增加；而IL-6除促进神经生长因子的分泌和对抗兴奋性氨基酸的神经毒性等作用外，还可抑制TNF-α分泌，减弱组织的炎性反应，参与脑组织的缺血性损伤后的神经保护和修复[6-7]。IL-6水平在脑缺血/再灌注过程的高表达，可能与中性粒细胞和巨噬细胞的浸润有关，而IL-6水平的持续性升高可能与星形胶质细胞大量分泌IL-6有关[8-9]。

　　因此奥扎格雷钠在脑组织缺血再灌注过程中的保护作用是通过直接抑制TNF-α对脑组织的损伤作用，间接增加IL-6对神经系统的保护作用来实现的。

1.赵晴,于挺敏等　奥扎格雷钠对大鼠急性全脑缺血再灌注损伤后Bcl22表达及抑制细胞凋亡的研究[J]老年学杂志2003.23(7):457-458

2.王芙蓉颈内动脉线栓法建立小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型Strokeand Nervous Diseases, 2003, 10:137-138.

3. Siren AL,Liu Y,Feuerstein etal.Increased release oftumor necrosis factor into the cerebrosPinal fluld and PeriPheral circulation of aged rats. Stroke，1993，24(6):880~888.

4.Czermak BJ,Sanlla V,Bless NM,SclmlaIH,el al.In vitro and in vivo dependency of chemokine generation on C5a and TNF-alPha[J].Imxnunol,1999Feb15; 162(4): 2321-2315

5. Baron FC,AvinB,White RF,el al. Tumor necrosjs factor-Q:a mediator of focal ischemic brain injury.Stroke，1997,28(6):1233-1244

6. Hupin,ToulmondS，SerranoA，etal.Increase in IL-6，IL-1 and TNF levels in rat brainfollowing traumatic lesion. J Neuroimmunol,1993,42:177.

7  崔丽,郑惠民,陶沂,等.脑梗死患者血清白介素-6、白介素-8、肿瘤坏死因子-α及白介素-1β水平的研究[J].中国综合临床2002,18(12):1083-1084.

8.SaitoK，SuyamaK，NishidaK，et al.Early increases in TNF-alpha，IL-6 and IL-1 beta levels following transient cerebral ischemia in gerbil brain. Neurosci-Lett，1 996,206(2-3):149-152

9. LoddickSA,TurnbullAV,RothwellNJ.Cerebra linterleukin 6 Neuro protective during permanent focal cerbralis chemia in th era. Jcereb Blood Flow Metab, 1998,18(2):176-179.