三维培养条件下WB-F344细胞膜流动性及粘附分子表达变化
作者：曲鑫建，孙世铎，丰美福
【摘要】 目的 探讨三维培养条件下对WB-F344细胞膜流动性的影响和粘附分子表达的变化。方法 通过荧光偏振法检测细胞膜流动性变化，并用半定量RT-PCR技术检测细胞粘附分子表达变化情况。结果 与平面培养的细胞相比，三维培养的细胞膜荧光偏振度与生物膜粘度下降，说明细胞膜流动性增加。三维培养和平面培养下，各种粘附分子均可表达，而三维培养条件下纤粘连蛋白（Fn）和整合素-β1（integrin-β1） mRNA的表达明显上调，整合素-α5的表达也有所增加。结论 三维培养可提高WB-F344细胞膜流动性从而维持细胞膜的功能，并上调粘附分子的表达。
【关键词】 右江民族医学院寄生虫学教研室，广西 百色 533000；西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100；院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京 100080）
捐赠肝脏的缺乏、肝细胞体外培养增殖能力有限、没有合适的肝细胞冻存条件等，都给肝病的细胞带来极大困难。肝干细胞具有自我更新和多潜能性，因此可能成为肝病细胞治疗以及组织工程理想的细胞来源。笔者以大鼠肝干细胞系WB-F344细胞为实验材料，采用RCCS系统模拟微重力效应，并以Cytodex-3为微载体对细胞进行培养（以平面培养的细胞为对照），分析微重力三维培养条件下细胞膜流动性变化和细胞粘附分子表达情况，旨在为肝组织工程及临床应用建立理想的体外细胞模型奠定理论基础。
细胞膜的各种重要功能如受体结合、离子转运、重摄取、膜结合酶活性等都与膜的流动性密切相关，膜的适宜流动是细胞维持正常生理功能的必要条件；而粘附分子在生物膜执行能量转换、物质转运、信息传递等重要生物学功能过程中也起着重要的作用。细胞表面粘附分子是细胞外基质中与粘附相关的蛋白或多糖分子受体，这些受体介导了细胞的粘附和移动，在细胞之间、细胞与基质之间的信息传输中起中心作用，同时在生理或结构水平上也起着信号转导作用［1，2］。
细胞三维培养通常以模拟细胞与细胞、细胞与基质间的相互作用来研究常规平面培养所难以揭示的细胞功能特征，所以本实验检测在三维培养下WB-F344细胞粘附分子表达及细胞膜的流动性变化情况。
1 材料和方法
1.1 设备和材料
1.1.1 实验仪器 旋转式细胞培养系统（RCCS，Synthecon，Inc 美国）； Cytodex-3微载体购自Sigma公司；日立20PR252D 高速冷冻离心机； 岛津带有偏振装置RF2540 荧光分光光度计；贝克曼DU27型紫外/可见分光光度计；PCR仪；流式细胞仪（Becton Dickinson公司）。
1.1.2 实验材料和主要试剂 WB-F344细胞株由中国医学科学院药理研究所赠送；培养基DMEM、胎牛血清（FBS）均为Gibco公司产品，购自北京科普佳公司；总RNA提取试剂盒（TRIzol）和RT-PCR试剂盒为Fermentas公司产品；PCR引物由北京奥科生物公司合成；焦碳酸二乙酯（DEPC）、总RNA提取试剂盒（TRIzol）和RT-PCR试剂盒为Fermentas公司产品；胰蛋白酶，Sigma，St.Louis，MO，USA，购自北京科普佳公司；氯仿、异丙醇、乙醇等其他试剂均为国产分析纯。DPH（1，6-二苯基-1，3，5己三烯）染液：2mmol/L DPH（1，6 -二苯基-1，3，5 -己三烯）的四氢呋喃贮液。
1.2 细胞膜流动性检测
1.2.1 实验原理 DPH是一种扁平长形分子，在水中几乎不发荧光，而在疏水环境，如脂双层中，荧光可增加一千倍之多，它能嵌入到脂双层中，和磷分子平行排列。假如烃链不活动，则DPH排列整齐，用一种偏振光去激发后，它所发出的荧光也是偏振的。假如烃链活动性很大，则DPH分子从吸收到发射这段时间内将随着磷脂分子的活动而有不同程度的倾斜，以致发射的荧光其偏振度减小。所以荧光偏振度越小，说明膜脂的流动性越大、微粘度越低。
1.2.2 WB-F344细胞平面培养 将WB-F344细胞先用无血清培养液洗2遍，加入10%血清的DMEM培养液吹打均匀，使细胞悬浮，计数后以1×105/cm2密度接种在6孔和24孔培养板中，放入37 ℃、饱和湿度，5% CO2培养箱中培养，每3天换液1次。
1.2.3 WB-F344细胞的三维培养 将RCCS系统放入CO2培养箱，用胰酶消化收获平面培养第3天的WB-F344细胞，以1×105/cm2的WB-F344细胞与1mg/ml Cytodex-3微载体（微载体Cytodex-3用70 %酒精过夜灭菌，接种前用PBS浸洗3遍）混合接种于硅化的培养瓶中，硅化的目的在于防止细胞贴壁。用含10 % FBS的DMEM培养液灌注10%胎牛血清DMEM培养液直到充满整个培养室，确保无气泡、无渗漏，并用胶塞塞紧瓶口，密封。将细胞培养瓶固定在回转器上，置于37 ℃恒温孵箱内进行水平轴回转。培养室的转速最初以12r/min运行，保证细胞和微载体呈悬浮状态。2～3天可不必更换培养液，以后根据细胞的生长状态和培养液的pH值，每24～48h全量换液。旋转速度应根据培养物体积的不断增大而酌情提高，速度的大小决定于培养物是否能良好地悬浮于培养室外壁与中轴之间的培养液里，使培养物跟随培养液同步旋转，适时取样观察细胞生长状态和微载体聚集的程度（在细胞培养的过程中，经常可形成多细胞的组织团，当组织团变大时，培养容器的旋转须相应地逐步加大，使组织团在培养容器内的始终处于悬浮状态，而不与容器壁相撞）。定期用倒置显微镜观察细胞在Cytodex-3微载体的贴附生长和形态变化。
1.2.4 细胞的准备 收集两种培养方式下的细胞，调整细胞密度至5×105/ml，DPH染液（2mmol/L）37 ℃孵育1min，1500r/min离心5min，弃掉上清加1ml PBS 37℃孵育10min后1500r/min离心5min，清洗3次，悬浮沉淀备用。各实验组3次重复。
1.2.5 偏光装置及分析条件 偏光装置由起偏镜和检偏镜组成，并配有控制偏光镜角度的调节杆。偏光器以螺丝固定于样品室，入射光线狭缝与起偏镜垂直，检偏镜与发射光线狭缝垂直。偏振器标尺角度的改变可以控制偏光前进的方向，见图1。
图1 偏光镜角度与偏光方向的关系（略）
偏光度的测定与：激发波长362nm，发射波长432nm，首先以PBS溶液测定I90°， 0°，I90°，90°的荧光强度，得出标正值G=I90°， 0°/I90°，90°，然后再测样品。
按公式：P=（IVV-GIVH）/（IVV+GIVH）计算标记细胞膜的偏振度。
P：荧光偏振度；
IVV：起偏器和检偏器光轴均在垂直方向的荧光强度；
IVH：起偏器处于垂直，检偏器处于水平方向的荧光强度；
G：荧光偏振校正因子。
生物膜粘度计算：根据Shinitzky等［3］建立的经验公式，偏振度与质膜的关系为：膜微粘度n（泊）=2P/（0.146-P）。
1.3 粘附分子mRNA表达检测 收集各组细胞，用Trizol核酸提取试剂盒提取各组细胞中总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度和浓度。采用莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV Reverse Transcriptase）试剂盒进行反转录。最佳扩增反应条件为：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，终末延伸10min。引物序列及长度和最佳退火温度见表1。PCR产物经1%琼脂糖（含0.5μg/ml EB）电泳，紫外透射仪观察拍照。
表1 RT-PCR引物序列、最佳退火温度和扩增长度（略）
2 结果
2.1 膜荧光偏振度与生物膜粘度的检测结果 见表2。
表2 细胞膜荧光偏振度与生物膜粘度的检测（略）
注：与对照组相比较，a：P<0.05，b：P<0.01
由表2可知，平面培养的细胞生物膜荧光偏振度为0.2476，而三维培养的细胞生物膜荧光偏振度为0.1368，较平面培养的细胞降低0.1108，差异有高度显著性（P<0.01）。膜粘度平面培养的细胞为1.2481，三维培养的细胞为0.9647，生物膜粘度降低0.3834，差异有显著性（P<0.05）。微重力三维培养细胞的膜荧光偏振度与生物膜粘度的下降，说明微重力培养状态下细胞膜的流动性增加。
2.2 细胞mRNA表达检测结果 纤连蛋白（fibronectin，Fn）的主要功能是介导细胞粘着。纯化的Fn可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，Fn可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。整合素（integrin）是一类重要的细胞粘着因子，是由α和β两个亚基形成的异源二聚体糖蛋白，介导细胞与基质、细胞与细胞之间的粘着。图2表明，微重力三维培养细胞各粘附分子如纤粘连蛋白、整合素-β1 （integrin -β1）、整合素-β4 （integrin -β4）、整合素-α1 （integrin-α1）和整合素-α5 （integrin-α5） mRNA均可表达，与平面培养细胞粘附分子表达模式基本一致，其中Fn的表达有上调趋势，可能是因为模拟微重力三维条件下，细胞呈悬浮生长，有较多的生长空间，从而使Fn的表达增加。
A：平面培养细胞B：旋转三维培养细胞
图2 WB-F344细胞粘附分子相关基因的RT-PCR分析（略）
3 讨论
质膜中脂双层结构如有磷酯与水分子存在，就产生液晶态。是固相转向液相的过渡状态，它既有液体的流动性又有固体（晶体） 的光学特性。其双折射现象可采用荧光偏振法进行测定［4］。影响膜脂流动的因素主要来自膜本身的组成成分以及遗传、环境的理化因素。细胞膜是由膜脂和膜蛋白构成的，通过膜脂和膜蛋白的协同作用，不仅为细胞的生命活动提供了稳定的内环境，对物质转运、信息传递等多种复杂的功能也起作用［5，6］。
细胞与细胞间的粘附是由特定的细胞粘着因子粘钙素等介导的，细胞之间的锚定连接需要粘着因子—粘钙素和整合蛋白等参与［7］。有研究发现［8］，三维培养时细胞间的接触和（或）细胞与胞外基质的接触能抑制细胞凋亡发生，其机理可能是整合素通过bcl-2通路来抑制凋亡。三维生长使细胞间的接触增多，粘附分子的表达也可能随之发生改变。因此，在构建了微重力三维培养肝干细胞模型后，我们通过RT-PCR技术检测了细胞粘附分子的表达。
检测Fn、整合素-β1、β4、α1和α5的mRNA表达情况，结果发现，微重力三维培养细胞7天时各种粘附分子mRNA均有表达，其中Fn的mRNA表达及与平面培养相比呈上升趋势，说明细胞与细胞间的连接增加、粘附增强，可能是细胞在三维条件下培养，细胞呈多层分布生长，而细胞为适应环境，分泌更多的粘附分子增加细胞之间、细胞与胞外基质之间的粘连。行使识别细胞外基质成分的整合素β4、α1的表达差异无明显变化，可能与检测时间有关。细胞在模拟微重力条件下，可能首先分泌一些重要的维持细胞生长的基质和细胞连接的粘附分子，为细胞的生长提供适宜的环境，然后进行更广泛的细胞间的连接。
生物体内各组织器官正常的生长发育及功能的发挥依赖于细胞与细胞，细胞与微环境间的相互作用，这些运动的完成，与膜脂的运动密不可分。膜表面粘附分子表达的改变，引起膜流动性改变，从而调节蛋白质的活动能力及结合酶的活性［9］。通过本实验的研究，发现三维培养状态下细胞膜的流动性显著高于平面培养的细胞。可能是微重力三维培养条件下细胞膜上分子表达改变、脂质与蛋白质相互作用方式改变、蛋白质分子重排，导致膜流动性改变。在一定范围内，膜的流动性大有利于膜中酶分子侧向扩散和旋转运动，使酶活性增加。在促进扩散和主动运输中，一些载体蛋白的运动性，决定于它们在膜中脂类分子的流动性。在细胞的信息传递，激素的作用等与膜的流动性有关同时也与细胞表面的分子也有关。在细胞膜上有信息传递系统，外界刺激通过膜将信息传递到细胞内引起一系列变化，最后作出相应的反应。如果膜不具有流动性，细胞的功能也就不能正常发挥。但是膜上粘附分子与膜脂的流动性具体的关系如何尚需要进一步研究。
【】
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