重组质粒载体pCMV?LRIG2转染BIU?87细胞株的效应研究
作者：李国灏，杨为民，叶章群，文博，刘征，郭东生
【关键词】 LRIG2；膀胱肿瘤；效应；Western?blot；RT?PCR
LRIG2基因是新近发现的一组基因——LRIGs基因的一种，他们编码的产物是一类结构相似的跨膜糖蛋白，在其胞外段有多个亮氨酸重复序列和Ig样结构域(tandem leucine?rich repeats and immunoglobulin?like domains, LRIG)[1?2]。研究发现，在多种肿瘤组织内有LRIG2基因表达水平的下调[2?3]。基于上述研究结果，我们拟通过基因转染技术，将外源性LRIG2基因导入膀胱肿瘤细胞株并进行筛选，观察转染后LRIG2基因对膀胱肿瘤生长能力、侵袭力及黏附力等生物学行为的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂来源 膀胱肿瘤细胞株BIU?87由我科实验室冻存；携带有LRIG2全长mRNA的重组质粒载体pCMV?LRIG2及兔抗人LRIG2蛋白多克隆抗体由瑞典Umea大学Hakan Hedman教授惠赠，该质粒携带有LRIG2全长mRNA及其终止序列，因而能够在真核细胞内表达LRIG2蛋白但不能表达GFP蛋白，故转染后的细胞不能产生绿色荧光；羊抗兔IgG二抗购自晶美公司；1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自四季青公司；限制性内切酶EcoRⅠ购自TaKaRa公司；质粒小量及大量提取试剂盒购自Omega公司；脂质体Lipofectamine2000购自Life Technologies公司；蛋白提取试剂盒购自Pierce公司；Transwell培养板购自Corning公司；基质胶购自Sigma公司。
1.2 细胞培养 BIU?87细胞株用含有10%(体积分数)胎牛血清(杭州四季青公司)的1640完全培养基在37℃、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。
1.3 质粒的小量提取与酶切鉴定 将重组质粒载体pCMV?LRIG2转化入感受态大肠杆菌DH5α菌株内，常规铺板，挑取菌落，扩增，采用质粒小提试剂盒提取质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳。
1.4 pCMV?LRIG2转染BIU?87细胞 将BIU?87细胞以1×106接种到6孔板中，待其生长到90%融合时，应用脂质体Lipofectamine2000按试剂盒说明书进行转染，分为空白组BIU?87(未转染)、对照组BIU87?GFP(转染pEGFP?N1)和实验组BIU87?LRIG2(转染pCMV?LRIG2)3组。
1.5 转染细胞的筛选 转染48h后用含有800μg/mL G418、10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640进行筛选，隔天更换一次培养液，待对照组细胞全部死亡(1周)后，换G418浓度为400μg/mL的培养液维持培养。2-3周后，生长出抗性克隆。经扩大培养、连续传代1-2个月，继而进行其他各项指标的检测。
1.6 蛋白的提取及Western Blot分析 收集3组细胞，应用动物蛋白提取试剂盒分别提取3组细胞的总蛋白，12000g离心15min，将上清转管于-80℃冻存。采用Bradford法测量蛋白浓度后，在8%(80g/L)SDS?聚丙烯酰胺凝胶上电泳，上样量为30μg总蛋白。电泳后，使用电转移仪将样品转至PVDF膜。用含5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入LRIG2兔抗人多克隆抗体(1∶50)、EGFR兔抗人多克隆抗体(1∶2000)室温作用1h。洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶1000)，室温作用1h。洗膜，压片，放射自显影。
1.7 细胞生长曲线的测定 用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别消化成单细胞悬液，调整细胞数为1×103/mL，接种于96孔板，并加含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液150μL，每组设24个复孔，未接种细胞的孔作空白对照。置于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。每天各组取3孔用MTT比色法进行检测，参照波长630nm，检测波长570nm，根据测定的A值绘制细胞生长曲线。
1.8 细胞侵袭力测定 采用Transwell法进行检测。用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别消化成单细胞悬液，调整细胞数为1×106/mL；用1mg/mL基质胶铺于8μm孔径的Transwell微孔滤膜上，下室加入2.6mL(含200μL趋化剂)10%(体积分数)胎牛血清培养基，将肿瘤细胞悬液以每室1.5mL加入上室，培养24h后，去除滤膜上层细胞行HE染色。镜下(×200)计数滤膜下表面细胞数，随机计数10个视野，平均值，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。
1.9 细胞同质黏附能力测定 采用细胞同质黏附实验。用2.5g/L的胰酶将3组细胞分别制成无血清1640培养基培养的单细胞悬液，按1×105/mL浓度接种于96孔板(100μL/孔)，每组设10个复孔，于37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中孵育。分别于60、90min后检测5个复孔，用37℃预热的D?Hanks液小心冲洗2次，收集未黏附的肿瘤细胞计数，从而计算出黏附细胞的数目。
1.10 统计学分析 应用SPSS12.0统计软件，采用两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
〖2〗泌尿外科杂志〖3〗第13卷
1期〖2〗李国灏，杨为民，叶章群，等. 重组质粒载体pCMV?LRIG2转染BIU?87细胞株的效应研究
2 结 果
2.1 质粒与酶切鉴定 根据所示，重组质粒pCMV?LRIG2全长约8.7kb，LRIG2的mRNA全长约4kb，空质粒pEGFP?N1全长4.7kb，将所提取质粒及其酶切产物电泳后可见三条片断长度分别为8.7kb、4.7kb及4.0kb(图1)，与预计相符。
2.2 细胞转染及稳定筛选 转染24h后可在倒置荧光显微镜(Nikon)下观察到对照组的细胞发绿色荧光，而实验组和空白组的细胞则不发绿色荧光。转染48h后，用含有800μg/mL G418、10%(体积分数)胎牛血清的1640培养基进行筛选，2周后，空白组细胞全部死亡，此时，将G418的浓度降为400μg/mL，3周后生长出抗性克隆。
2.3 Western Blot检测结果 3组细胞中LRIG2和EGFR表达的Western Blot分析显示，与对照组和空白组相比，稳定转染LRIG2基因后的BIU?87细胞LRIG2蛋白表达明显升高，而EGFR蛋白表达明显降低(图2)。
图2 三组细胞LRIG2和EGFR蛋白Western?blot检测结果
2.4 细胞生长能力 培养1d后，对照组和空白组的细胞A值即开始超过实验组细胞，随着时间的延长，差异逐步增大；8d后差异显著(图3)。提示转染了LRIG2基因的BIU?87细胞生长速度比对照组和空白组的BIU?87生长速度慢。
2.5 细胞侵袭力 基质胶能在Transwell培养板的微孔滤膜上形成类似天然基底膜的结构，故细胞穿过图3 MTT法绘制的三组细胞生长能力曲线该基质胶的能力能反映细胞的侵袭力。结果发现，与对照组及空白组相比，实验组的侵袭细胞数目明显减少，差异有显著性(P均<0.01)；而对照组同空白组相比无显著性差异(P>0.05，表1、图4)。提示转染了pCMV?LRIG2质粒的细胞侵袭力显著下降，而转染空pEGFP质粒的细胞侵袭力无明显改变，即影响细胞侵袭的因素为质粒所携带的LRIG2基因。
2.6 细胞同质黏附能力 黏附60min及90min后计数黏附的细胞，结果显示实验组黏附的细胞数均显著高于对照组及空白组，其差异均具有显著性(P<0.01)；而对照组及空白组在两个时段的黏附细胞数目差异则无显著性(P>0.05,表2)。提示转染了pCMV?LRIG2质粒的细胞其黏附能力明显升高。表1 三组细胞侵袭力检测结果表2 三组细胞黏附力检测结果 *P<0.01 vs.空白组和对照组
3 讨 论
在肿瘤的生长过程中，产生足够的生长信号是至关重要的一步，因此在肿瘤细胞中，生长因子受体的活性往往会明显增强[1]。表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c?erbB?2的表达产物,是一种有蛋白激酶功能的跨膜蛋白,位于细胞信号通路的起始处，对细胞的生长、增殖、黏附和迁移等生物学特性起关键作用。它参与上皮增生过程的跨膜信号传导,是细胞膜信号传递过程中的重要物质,当EGFR介导的信号通路中某一成分的基因发生易位、突变、丢失或重排等都可引起细胞恶变。EGFR在多种肿瘤细胞的生长、增殖、分化、黏附和迁移中起重要作用[4?5]。
LRIGs基因是最近几年发现的一组新的基因家族，在哺乳动物体内广泛存在，目前发现其至少有三个成员：LRIG1、LRIG2和LRIG3[1?2,6]。它们的碱基序列具有高度同源性，编码产物均为一类结构相似的跨膜糖蛋白：在其胞外段有多个亮氨酸重复序列和Ig样结构域[1?2,6]。Gal等[7]对LRIG1的研究发现，LRIG1的胞外段能与EGFR结合，阻遏了EGF与EGFR的结合，并且能够加速EGFR的降解与泛素化，从而起到抑制EFG?EGFR信号转导的作用，进而影响细胞的生长、增殖、分化和黏附等生物学行为。
LRIG2基因表达于包括膀胱在内的人体绝大多数组织器官，其染色体定位为1p13——一个多种肿瘤基因缺失的好发部位。鉴于LRIG2同LRIG1在基因序列和蛋白结构上的高度同源性及其特殊的染色体定位，我们推测其在调控肿瘤细胞生长、分化过程中有类似的作用。据此我们利用携带有LRIG2基因的重组质粒载体pCMV?LRIG2转染膀胱肿瘤细胞株BIU?87，观察转染后LRIG2和EGFR蛋白水平的变化，以初步了解两者之间的关系，同时观察转染后肿瘤细胞在侵袭力、黏附力、生长能力等生物学行为方面的改变。
Transwell法是目前检测细胞侵袭力的常用方法之一，培养板上的微孔滤膜在铺上基质胶之后能够形成类似天然基底膜的结构，细胞穿过该人工基底膜同样需要分解基质胶，并通过变形穿过滤膜上的8μm微孔，而下室的趋化剂则诱导细胞跨过该微孔滤膜，故在一定时间后计数下室的细胞数目能反映该细胞的侵袭能力。
本研究显示，在转染了携带有LRIG2基因的质粒后，膀胱肿瘤细胞株BIU?87的侵袭力及生长能力显著下降，而黏附能力显著上升，即LRIG2基因有明显的抑制该肿瘤生长、侵袭的作用。同时，通过Western－blot检测发现，在转染LRIG2基因后，细胞内LRIG2蛋白表达水平升高，而EGFR表达明显减弱，提示LRIG2同EGFR的表达呈负相关。这与Tomasson等[8]对LRIG1的研究结果相类似。
基于上述研究结果及目前对于LRIG1的研究，我们推测LRIG2和LRIG1一样，也可能是一种抑癌基因，当其表达水平降低时，对EFG?EGFR信号转导途径的负反馈抑制作用减弱，导致肿瘤细胞的生长、分化、转移；而在其表达水平升高时，通过与EGFR结合，阻遏了EGF与EGFR的结合，并且能够加速EGFR的降解与泛素化，从而起到抑制EFG?EGFR信号转导的作用，进而延缓肿瘤细胞的生长、分化、转移，增强肿瘤细胞的黏附能力。
当然，肿瘤细胞的生长、分化和转移是受多重基因调控的，LRIG2对它的调控也只是众多调控过程中的一个环节，因而其对肿瘤生物学行为的影响也是有限的，其基因的应用也受到一定的限制。在下一步研究中，我们拟进一步了解在LRIG2?EGFR调控过程中有无其他因素的参与、该调控过程上下游的具体机制等问题，为以该基因为靶点的基因治疗提供更充实的依据。
【】
/[1/]Nilsson J, Vallbo C, Guo D, et al. Cloning, characterization, and expression of human LIG1 /[J/]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 284(5):1155?1161.
/[2/]Holmlund C, Nilsson J, Guo D, et al. Characterization and tissue?specific expression of human LRIG2 /[J/]. Gene, 2004, 332:35?43.
/[3/]Hedman H, Nilsson J, Guo D, et al. Is LRIG1 a tumor suppressor gene at chromosome 3p14.3 /[J/]? Acta Oncol, 2002, 41(4):352?354.
/[4/]Kolibaba KS, Druker BJ. Protein tyrosine kinases and cancer /[J/]. Biochim Biophys Acta, 1997, 1333:217?248.
/[5/]Schlessinger J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases /[J/]. Cell, 2000, 103:211?225.
/[6/]Guo DS, Holmlund C, Henriksson, et al. The LRIG gene family has three vertebrate paralogs widely expressed in human and mouse tissues and a homolog in Ascidiacea /[J/]. Genomics, 2004, 84:157?165.
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/[8/]Thomasson M, Hedman H, Guo D, et al. LRIG1 and epidermal growth factor receptor in renal cell carcinoma: a quantitative RT?PCR and immunohistochemical analysis /[J/]. Br J Cancer, 2003, 89:1285?1289.
