生殖支原体表达水平及核苷酸序列变化与女性生殖道炎症的相关性分析
【摘要】 目的：了解女性生殖道中生殖支原体(Mg)的感染情况。方法：用套式聚合酶链反应技术(nPCR)对女性生殖道分泌物211例、组织231例进行Mg 16 SrRNA基因片段检测及核苷酸序列分析。结果：生殖道炎症组（组织24/67例，分泌物59/173例）的检出率均显著高于非炎症组（组织6/164例，分泌物2/38例）P＜0.000 01；在卵巢、输卵管、子宫组织中，宫颈炎（6/30）和宫颈炎性息肉（18/37）的检出率与非炎性组织比较P＜0.05；在各种阴道炎（57/153）中，淋菌性（16/63）、霉菌性（24/52）、滴虫性（13/29）阴道炎检出率与正常人（1/38）比较，差异有显著性，P＜0.000 1；对5例Mg阳性标本的16S rRNA基因片段一级结构序列分析，发现与国际标准株Mg 37同源性达97.8%，有一个T碱基插入。结论：Mg的感染与女性生殖道炎症密切相关。
【关键词】 套式PCR；生殖支原体；生殖道炎症；DNA测序
The Prevalence and Signifance of Expression and Nucleotide Sequence of Mycoplasma Gentalium among Female Patients with Reproductive Tract Infectious Diseases
LI Lu, YANG Shu?lan，MOU Qin?feng
The Third Affiliated Hospital of Suzhou Univesity，Changzhou, Jiangsu 213003, China
Abstract： Objective To find out the prevalence of mycoplasma gentalium(Mg) infection among female reproductive tract infectious diseases. Methods The nested polymerase chain reaction technique and nucleotide sequence analysis targeting the 16SrRNA gene for detecting mycoplasma infection in 211 secretion samples and 231 tissue samples from female reproductive tract infectious disease patients. Results The positive rates of the 16SrRNA gene among patients with reproductive tract infectious diseases are much higher than those among none?infectous disease patients；The positive rate of 16SrRNA gene among patients with cervicitis and cervices inflammatory polyp is much higher than the other inflammatory reproductive tract deseases. The 16SrRNA gene load among gonorrheal viginitis, trichomonal viginitis and candidly viginitis are much higher than control group respectively. Conclusion Mycoplasma gentalium is closely correlated to the female reproductive tract infectious diseases；The analysis of primary structure of 16 SrRNA revealed that the homology was 97.8% compared with the international standard Mg37 strain, only besides a T insertion.
Key words： nPCR； Mycoplasma gentalium； Female reproductive tract infectious diseases； Nucleotide sequence
生殖支原体（Mycoplasma genitalium， Mg）是在人类中发现的第12种支原体，并已证明与人类的男女性泌尿生殖道炎性疾病相关［1］。以往的研究主要集中在对生殖道分泌物进行检测，但对相关组织进行检测的报道较少，为此我们将这两者结合起来，采用简便、敏感、特异的套式PCR法［2］，检测了女性生殖道分泌物（211例）和组织（231例）中Mg 16 SrRNA基因的表达情况，进一步探讨Mg的感染与女性生殖道炎症的关系。现报告如下。
1 对象与方法
1.1 研究对象
1.1.1 正常对照组
非炎性病例202例，均经临床及实验室诊断排除淋菌、解脲支原体、沙眼衣原体、宫颈炎及宫颈炎性息肉。 其中：分泌物标本38例，本院门诊体检健康女性，年龄22岁~55岁，平均年龄33.5岁；组织标本164例，其中卵巢巧克力囊肿20例，卵巢畸胎瘤20例，黄体破裂出血20例，输卵管妊娠46例，子宫平滑肌瘤20例，子宫内膜增生过长38例。年龄18岁~46岁，平均年龄34岁。
1.1.2 炎症组
炎性分泌物173例，其中淋菌性阴道炎43例，霉菌性阴道炎52例，滴虫性阴道炎29例，其他阴道炎29例，盆腔炎20例,均为本院妇科门诊患者，经临床和实验室诊断为生殖道炎症,年龄18岁~45岁，平均年龄31.5岁；组织炎性标本67例，经病理诊断为宫颈炎30例和宫颈炎性息肉37例，年龄18岁~48岁，平均年龄33岁。
1.2 方法
1.2.1 生殖道分泌物标本的采集
用无菌棉拭子采集宫颈分泌物，置1.5 ml Eppendorf管中，加入50 μl裂解液，2 μl蛋白酶K，置55℃水浴1 h。
1.2.2 生殖道组织标本采集处理
用石蜡包埋的组织2片~3片（每片约5 μm厚）。置1.5 ml Eppendorf管中，加入1 ml STE缓冲液（0.5%SDS+10 mmol/L Tris HCl+1 mmol/L EDTA，pH 7.8）置72℃水浴10 min，插入无菌滤纸条吸掉浮面的石蜡，用加样器吸弃剩余STE液，重复上述过程3次，再4 000 rpm离心5 min，吸弃上清STE液。加裂解液100 μl，蛋白酶K 4 μl置37℃过夜。
1.2.3 DNA模版的制备
将经上述处理后的标本置95℃以上水浴10 min，再15 000 rpm离心5 min，上清液即为DNA扩增模版。
1.2.4 套式PCR扩增
以Mg的16S rRNA基因为靶基因，套式PCR参数、灵敏度、特异性试验参见［7］，试剂由无锡市克隆技术研究所提供。严格按照操作说明书操作。
1.3 统计方法
采用SPSS 10.0进行χ2检验。
1.4 核苷酸序列测定
将PCR扩增后阳性产物交由院上海植物生理研究所国家重点实验室测定。Mg标准株由美国（National Center for Biotechnology Information ）提供，株名MgG?37。
2 结果
2.1 Mg 16S rRNA基因套式PCR检出率比较
见表1。表1 Mg 16S rRNA在女性生殖道的检出率比较（略）注：*与非炎性病例比较P＜0.01。
2.2 女性生殖道组织中Mg 16S rRNA基因检出情况
见表2。表2 女性生殖道组织中Mg 16S rRNA基因检出情况（略）注：与非炎性病例比较*P＜0.05，##P<0.01。
2.3 女性生殖道分泌物中16S rRNA基因检出情况
见表3。表3 女性生殖道分泌物中16S rRNA基因检出情况（略）注：与非炎性病例临床正常人比较*P＜0.01，##P>0.05。
非炎性病例与其他阴道炎、盆腔炎比较，16S rRNA基因检出率差异无显著性。与淋菌、霉菌、滴虫性阴道炎16S rRNA基因检出率相比，差异有非常显著性，P＜0.01。
2.4 女性生殖道Mg 16S rRNA基因片段一级结构分析见图1。
对女性生殖道组织和分泌物，炎症与非炎症标本的Mg阳性5例，做Mg 16S rRNA基因片段的一级结构序列分析，并与国际标准株（由美国NCBI提供）MgG?37序列做对比分析，结果发现本地区女性生殖道的Mg 16S rRNA基因都有一个T碱基的插入，与标准株同源性为97.8%。
3 讨论
自从1981年Tully教授发现Mg以来，国内外学者相继在泌尿、生殖、呼吸、关节、心肌等部位证实了Mg的存在［3，4］。以往Mg的检测均集中在非淋菌性尿道炎和性传播疾病方面［5，6］。我们应用灵敏、特异、可靠的nPCR技术［7，8］，检测了Mg具有种特异性的多拷贝基因16S rRNA基因［7］。对442例女性生殖道分泌物和组织进行Mg 16S rRNA基因检测。结果发现在正常女性生殖道中亦有Mg的存在。其中阴道分泌物检出率为2/38，子宫内膜为2/38，卵巢畸胎瘤2/20，子宫平滑肌瘤1/20。这进一步证实Mg存在部位的广泛、无选择性［8］，这应当引起我们高度注意它的存在和潜在危险性。
有报道认为Mg是条件致病体，或者称之为机会感染源［9］。我们发现女性生殖道各部位炎症时Mg的检出率达10.0%~46.1%，其中淋菌性（16/63）、霉菌性（24/52）、滴虫性（13/29）阴道炎检出率比正常人显著增高。这种高比例的混合感染的原因可能是炎症使生殖道黏膜受损，使支原体更易进入宿主细胞［2］，在一定条件下使宿主更易被支原体感染；这提示临床在生殖道炎性疾病的诊疗中除重视淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体的检测外不可忽视Mg的检测。
另外抗生素的大量不规则应用，使得微环境发生变化，菌群失调，导致易感性增高，从而使同时感染其他病原体的机会增加。为此，我们提示临床，为使患者能获得正确诊断和合理。加强对Mg感染的检测，是当前妇科炎症诊疗中不容忽视的一个环节。
对5例Mg阳性标本（包括1例正常人阳性标本）做16S rRNA基因片段一级结构分析表明，本地区女性生殖道内检出的Mg与国际标准株具有高度的遗传同种性，该基因片段的同源序列达97.8%，其遗传特征为一个T碱基的插入。
【文献】
［1］骆丹.生殖支原体［J］.国外医学皮肤性病学分册，1996，3：156.
［2］孙蓉，孙峰，唐尧，等.扬州市性传播疾病患者支原体、衣原体、淋病奈瑟菌及阴道加特纳菌感染情况的研究［J］.中华流行病学杂志，2004，2：145?149.
［3］陈华，陈静琴，季桂兰，等.生殖支原体和人微小病毒感染与围产儿结局不良的关系［J］.江苏医药，2000，11：875?877.
［4］Taylor Robinson D，Tully J.G，Barile M.F. Urethral
infection in male chimpanzees produced experimentally by Mycoplasma genitaliumBr［J］. J Exp Pathol，1985，66：95?101.
［5］俞信忠，许平，袁江英，等.女性淋病患者7种支原体感染情况分析［J］.皮肤性病学杂志，2002，16（6）：396?397.
［6］王荷英，施美琴，叶顺章，等.非淋菌性尿道炎的生殖支原体检测［J］.中华皮肤科杂志，1998，31（3）：149?151.
［7］糜祖煌，秦玲.生殖支原体套式PCR检测研究［J］.中国优生与遗传杂志，1998：617?618.
［8］Calsamiglia M，Pijoan A.Application of a nested polymerase chain reaction assay to detect mycoplasma hyopneumoiae from nasal swabs［J］. J Vet Diagn Invest，1999，11（3）：246?251.
［9］王自正，王书奎，骆丹.多重聚合酶链反应检测生殖支原体感染［J］.中华医学检验杂志，1998，21（1）：36?39.
