药物对肾小球抑制作用的对比分析

　　关键词：肾小球 药物 作用 对比

　　论文摘要：采用体外培养的人肾小球系膜细胞技术，观察具有降逆泄浊、益气活血功效的中药肾康注射液及苯那普利对ECM不同成分的影响。肾康注射液具有抑制ECM成分中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)的作用，该抑制作用具有一定的量效关系。苯那普利对ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但不及肾康注射液作用明显。结论，肾康注射液对ECM的抑制作用优于苯那普利。 
　　近年来，随着对肾小球硬化机制认识的不断深入，肾小球系膜细胞(MC)、细胞外基质(ECM)及各种细胞因子在肾功能进行性减退过程中所起的作用倍受关注。抑制MC增殖，减少ECM的堆积，拮抗细胞因子的不良作用，已成为防治肾小球硬化，延缓CRF病情进展的重要环节。 
　　一、对比研究使用的材料 
　　选用的材料 
　　1、肾组织来源系我校附属妇产科孕5月引产胎肾。 
　　2、药物与试剂肾康注射液(SKI)由大黄、丹参、红花等组成，成都中医药大学附属医院提供，每毫升含原生药0.3g；苯那普利(Benayzepril)由瑞士诺华制药有限公司生产，批号：012200；V型胶原酶、HEPES均系Sigma产品；RPMI 1640、胰蛋白酶、胰岛素均为美国GIBCO产品；小鼠抗人单克隆FN抗体、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均购于北京中山生物技术有限公司；LN、Col Ⅳ放射免疫分析试剂盒，均购于上海海研医学生物技术中心。 
　　3、主要仪器CO2孵箱(TYPE4型)德国HERAEUS公司生产；倒置显微镜(TOKYO)日本OLYMPUS公司生产；洁净工作台(月坛牌)北京半导体设备一厂生产；酶标分析仪(MODEL2550)美国BTO-RAD公司生产；FT-613自动计数125 I放免测量仪，北京核仪器厂生产。 
　　二、研究采用的方法 
　　1、MC培养与鉴定无菌取胎肾，分离提取肾皮质小球组织，按照于力方等方法(1)取去掉包囊的单个肾小球进行原代和继代培养，实验中使用传代5代的MC。培养的细胞经免疫病理鉴定证实为单纯的MC，无上皮细胞、肾小管细胞及成纤维细胞污染。 
　　2、分组及MC上清的收集吸取培养的第5代MC培养瓶中液体，加胰酶1ml，置孵箱(5%CO2、37℃)中消化3min，加10% FCS 1640终止液2ml，抽吸于离心管中，800rpm，离心3min，弃上清，加15% FCS 1640培养液于离心管中，吹打，混匀。用计数板计数后，倾入加样槽中，用8导加样枪，按每孔200μl，密度4000/孔铺板。将96孔板按列从左至右依次分为空白对照组(简称组Ⅰ)、苯那普利组(简称组Ⅱ)、肾康注射液高浓度组1、2(简称组Ⅲ、组Ⅳ)、肾康注射液中浓度组1、2(简称组Ⅴ、组Ⅵ)、肾康注射液低浓度组1、2(简称组Ⅶ、组Ⅷ)，共8组(列)，每列6孔，待细胞贴壁24h后，每孔加无血清1640培养液200μl同步24h。除空白对照组外，其余各组分别依次加入苯那普利10－3mmol/L及肾康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml，待刺激48h后依次收集上清待测。 
　　3、测定ECM中FN的含量用双抗体夹心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗体原液用包被缓冲液稀释1000倍。取96孔板，50μl/孔铺板，4℃过夜，甩去。用PBS－吐温20洗涤液洗板3次，每次3min，间隔2min，控干。每孔加1%BSA封闭液100μl，37℃，1h后甩去，控干。依次按组各孔分别加入待测上清50μl，37℃，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA·PBS1∶1000稀释)50μl/孔，室温放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA·PBS1∶1000稀释)50μl/孔，室温放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD显色液50μl，预热酶标仪，用2M H2SO4终止液50μl/孔终止，立即在492nm波长读数，并记录OD值。 
　　4、ECM中LN、Col Ⅳ含量的放射免疫法(RIA)测定采用竞争法，将缓冲液稀释10倍，分别将125 I－LN、抗LN血清、125 I－ColⅣ、抗ColⅣ血清及二抗用缓冲液稀释，将待测上清分别与125 I－LN、125 I－ColⅣ及相应的抗血清混匀，4℃过夜反应，加二抗4℃反应60min，离心3500r/min 10min弃上清，125 I放射免疫测量仪计数。 
　　5、统计学处理数据均采用SDAS软件进行统计处理，结果用(±s)表示。 
　　三、研究的结果 
　　肾康注射液与苯那普利对ECM成分含量的影响，在对ECM中FN含量影响方面，肾康注射液组(Ⅲ～Ⅶ组)与空白对照组(Ⅰ组)相比，均有显著性差异(P＜0.05～0.01)；说明肾康注射液除低浓度组2(Ⅷ组)外，其余各组对FN均有明显的抑制作用，而且随着浓度的递增此作用更加明显，并表现出一定的量效关系。实验还发现肾康注射液即使在极小浓度时对ECM中LN及Col Ⅳ的含量也有明显的抑制作用，该抑制作用也呈现出一定的量效关系。苯那普利组(Ⅱ组)在对FN、Col Ⅳ含量影响方面，与空白对照组相比也有显著性差异(P＜0.01～0.05)；但对LN影响方面，两者比较无显著性差异(P＞0.05)；说明苯那普利对ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但对LN其抑制作用不明显。另外，从表中还可看出，肾康注射液各浓度组(Ⅲ～Ⅷ组)与苯那普利组相比，在抑制LN方面也均有极显著性差异(P＜0.01)；除肾康注射液低浓度组2(Ⅷ组)外，其余各组与苯那普利组相比，在抑制Col Ⅳ方面也有显著性差异(P＜0.01～0.05)；肾康注射液高浓度组(Ⅲ组)与苯那普利组相比，在抑制FN方面也有显著性差异(P＜0.05)；说明肾康注射液在抑制ECM中FN、LN、Col Ⅳ含量方面优于苯那普利。 
　　四、讨论 
　　肾小球硬化时ECM的改变是近年来国内外肾脏病学者研究的热点之一，ECM在肾小球内的蓄积，是肾小球硬化的主要特征性变化。 
　　苯那普利是第四代血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)。现已证实，肾脏具有独立的肾素－血管紧张素系统(RAS)，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是该系统最具有生物活性的因子。目前研究证实AngⅡ受体(ATR)至少有Ⅰ和Ⅱ两种亚型，其中Ⅰ型受体(ATR1)意义最大。该受体分布在肾小球MC上，与AngⅡ、AngⅢ有高度的亲和力。进一步的研究还发现ATR1占肾内ATR亚型分布的90%以上，Osborne等在10余年前就报道动脉内注射3H标记的AngⅡ，发现3H-Ang Ⅱ只结合在肾小球系膜区，而不与肾血管、肾小管等部位结合。用125 I-AngⅡ进一步实验发现光镜下125 I-AngⅡ位于肾小球上，电镜下125 I-AngⅡ颗粒在MC浆中。血管紧张素转化酶是RAS中最后一级酶促反应的关键酶，用ACEI能够抑制AngⅡ的形成，可使循环和组织中的AngⅡ水平下降，且可直接降低肾内AngⅡ的生成量，从而对抗AngⅡ对肾脏的不良反应，减轻肾小球硬化的发生。大量的研究还证实，ACEI除减轻肾小球的高灌注和高滤过作用外，还可通过阻断肾小球基底膜(GBM)上AngⅡ的特异作用的结合点，可使GBM固有的负电荷增多，并抑制GBM的进一步增厚，从而直接改善GBM的通透性。目前体内外动物实验还证实，ACEI亦有抑制肾小球MC和系膜基质增生的作用，从而直接阻止肾小球硬化的形成。近年来，临床上已成功地将ACEI用于各类肾脏病的，发现在降低蛋白尿，阻止肾小球硬化方面具有一定的作用。 
　　本实验结果表明，肾康注射液对ECM中FN、LN、Col Ⅳ的含量具有明显的降低作用，并呈现出一定的量效关系。苯那普利虽对FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但此抑制作用远不及肾康注射液明显。从而提示MC是肾康注射液发挥治疗作用的重要靶细胞，减轻ECM的积聚可能是肾康注射液延缓肾小球硬化的重要作用机制之一。值得注意的是，苯那普利主要是通过抑制AngⅡ的形成，减轻其对肾脏的损害，从而在阻止肾小球硬化方面发挥着重要作用，而肾康注射液是否对AngⅡ的形成也有一定的抑制作用，值得进一步深入探讨。