芍药苷对LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响

                     作者：常蕴青 赵中夫 刘明社

【摘要】  目的：观察芍药苷对脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核/巨噬细胞株(RAW264.7)高迁移率族蛋白B1（HMGB1）释放和表达的影响。方法：体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞培养三代后，转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔培养板中，将细胞分为对照组、LPS刺激组（100 ng/mL）、芍药苷组（LPS 100 ng/mL＋芍药苷0.625 mg/mL）；LPS刺激20 h后，免疫细胞化学法检测各组培养细胞HMGB1的表达水平。结果：LPS刺激RAW 264.7细胞20 h后，LPS组细胞核HMGB1特异性染色变淡，胞浆染色加深，表明HMGB1从胞核转移到胞浆; 芍药苷组大部分细胞核HMGB1特异性染色深，而胞浆染色浅，表明芍药苷抑制HMGB1从胞核转移到胞浆。对HMGB1免疫组化数字图像的累积光密度值分析显示，HMGB1含量在三个实验组间差异有统计学意义（F=918.67，P<0.01），LPS刺激组和芍药苷组间差异有统计学意义（q=22.66,P<0.01）。结论：芍药苷可能通过抑制HMGB1的核转位和释放，对LPS诱导的肝损伤起保护作用。

【关键词】  芍药苷；脂多糖；小鼠腹腔巨噬细胞；高迁移率族蛋白B1

    Abstract  Objective：To investigate the effects of paeoniflorin on the expression of high mobility group box1(HMGB1) in RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods: RAW264.7 Macrophages were cultured to the third generation in six wells plate and divided into three groups : control group, 100 ng/mL LPS treatment group and 0.625 mg/mL paeoniflorin treatment group. After 20h treatment, the expression of HMGB1 was measured by immunohistochemical method . Results: At 20 h after RAW264.7 cells stimulated by LPS, LPS group showed nucleus HMGB1-specific stained light, cytoplasm stained deepened. It was indicated that HMGB1 was transfered from the nucleus to the cytoplasm. Paeoniflorin group showed the release of HMGB1 of  the majority of cells was inhibited. HMGB1-specific staining nuclei became darker. cytoplasm staining shallow. Integrated optical density of HMGB1 immunohistochemic digital image analysis showed that HMGB1 among three groups were significantly different (F=918.67，P<0.01). The difference between LPS group and Paeoniflorin groups was statistical significance（q=22.66,P<0.01）. Conclusion: Paeoniflorin can protect liver injury under LPS stimulation through inhibiting the tranfer and release of HMGB1.

    Key words  Paeoniflorin;Lipopolysaccharide;RAW264.7 macrophages;High mobility group box 1(HMGB1)

    芍药苷(paeoniflorin，Pae) 为一种蒎烷单萜苷，主要存在于毛莨科植物芍药（Paeonia lactiflora

    Pall）的根皮部，以中药赤芍中含量最高，毒性极低，具有镇静、解痉、抗炎、免疫调节和保肝等作用［１］。本实验拟通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激小鼠巨噬细胞系建立炎症细胞模型，观察芍药苷对LPS诱导的RAW264.7细胞HMGB1表达的影响，以探讨芍药苷对其是否具有保护作用，进而深入了解芍药苷抗炎作用机制，为进一步研究开发防治肝病的药物提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  主要试剂

    芍药苷：南京替斯艾么中药研究所；小鼠单核/巨噬细胞株(RAW264.7)：中科院上海细胞库；HMGB1抗体：英国 Abcam公司；新生牛血清（FCS）：杭州四季青公司产品；RPMI-1640：美国Gibco公司；胰蛋白酶：美国Sigma公司；EDTA：华美生物工程公司； UltraSensitiveTM SP超敏试剂盒：福州迈新公司；Tritonx-100：北京中山试剂公司；LPS：美国Sigma公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1.  RAW264.7细胞的培养：复苏后的RAW264.7细胞置于含100 U/mL青霉素、100 U/mL 链霉素、10％新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中培养。为防止LPS干扰，培养基中加入了10 μg/mL的多粘菌素B。37 ℃、5％CO2孵箱中培养，待细胞融合80％后，以0.25％胰蛋白酶＋1 mmol/L EDTA溶液消化传代。

    1.2.2  细胞活性鉴定：台盼蓝拒染实验：将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液，取0.5 mL 0.4%的台盼蓝染液、0.3 mL HBSS和0.2 mL细胞悬液，充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，计数其中着色的细胞。

    细胞活力=(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%

    1.2.3.  芍药苷抑制LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1释放的免疫组化实验：将培养板作好标志分别为A板、B板、C板，每组设三个复孔。正常对照组（A1-A6）：培养液1 mL；LPS组（B1-B6）：培养液+ LPS 100 ng/mL；芍药苷组(C1-C6)：培养液+LPS 100 ng/mL+Pae 0.625 mg/mL。各孔细胞在受LPS刺激前先换成无血清的RPMI-1640培养液，孵育2 h后以相应剂量的LPS刺激，均于刺激20 h后，小心取出培养孔内载玻片，进行免疫组化实验。弃去培养液，PBS洗2次；4％的多聚甲醛固定15 min, PBS洗3次，每次3 min;每张切片加一滴H2O2阻断剂溶液，室温孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min; 每张切片加一滴非免疫动物血清，室温孵育10 min;加入含0.3％Tritonx-100的PBS，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min; 除阴性对照孔外，每张切片加一滴1∶250稀释的抗体，4 ℃过夜; 次日晨，从冰箱取出，室温下30 min,PBS洗3次，每次3 min;每张切片加一滴生物素标记的二抗，室温孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min; 每张切片加一滴链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min; 每张切片加二滴DAB显色剂，显微镜下观察3 min，自来水冲洗1 min，苏木素复染2 min，Hcl-酒精分色30 s，PBS返蓝；梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，晾干。每组实验重复3次。

    显微镜下观察并拍照，选取染色清晰的切片5张，于光镜下(×20)随机选取5个视野，应用OLYMPUS-BX51图像采集系统，Image-Pro5.0图像分析系统测定累积光密度值（IOD）。

    1.3  统计学分析

    采用SPSS12.0软件包分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为差异有显著性。

    2  结果

    2.1  各实验组细胞活性无明显改变

    经台盼蓝拒染实验观察各实验组细胞活力均大于95%，表明实验所加各种物质没有影响RAW264.7细胞的活力，排除细胞坏死HMGB1的被动释放因素。

    2.2.  芍药苷抑制 RAW264.7细胞释放HMGB1

    LPS刺激RAW264.7细胞20 h后免疫组化结果显示: 正常培养的小鼠腹腔巨噬细胞未刺激时HMGB1聚集在细胞核内，胞浆淡染；LPS组表现为细胞体积增大，伪足伸出，细胞核HMGB1特异性染色变淡，部分细胞胞核染色变蓝，胞浆染色加深。芍药苷组细胞体积改变不明显，大部分细胞HMGB1的释放被抑制，细胞核HMGB1特异性染色深，胞浆染色浅(见图1)。

    2.3.  各实验组细胞释放HMGB1免疫组化的IOD检测结果

    各组细胞释放HMGB1免疫组化结果的数字图像经Image-Pro5.0分析处理后，其细胞HMGB1含量的IOD值（x±s）为：对照组0.054±0.003；LPS刺激组0.176±0.009；芍药苷组0.130±0.005。ANOVA分析表明三个实验组间胞浆的HMGB1含量差异有统计学意义（F=918.67, P<0.01）；LPS刺激组和芍药苷组间差异有统计学意义（q=22.66,P<0.01），LPS刺激组与对照组间差异有统计学意义（q=60.02,P<0.01），芍药苷组与对照组间差异有统计学意义（q=37.36,P<0.01）。

    3  讨论

    RAW264.7细胞是被广泛用于体外实验的巨噬细胞系，当受到LPS刺激后能表达和释放包括HMGB1在内的多种细胞因子。HMGB1是广泛存在于真核细胞内高度保守的非组蛋白染色体蛋白，多种器官(如淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等)的细胞中均有表达，位于大多数细胞的胞核和胞浆内，它可参与DNA的复制、细胞分化及基因表达等多种细胞生命活动。HMGB1除了由坏死细胞被动释放外可由多种细胞主动释放，如人外周血单个核细胞、巨噬细胞株RAW264.7细胞、脐静脉内皮细胞等［２～4］。HMGB1一旦释放到细胞外介质，它就能激活免疫反应。Wang等［５］发现，用内毒素、TNF或IL-1刺激培养的巨噬细胞株RAW264.7细胞 8 h后在细胞培养液上清可检测到HMGB1。用亚致死量内毒素攻击小鼠,8 h检测到血浆HMGB1，16 h达高峰，并持续至32 h，研究结果显示HMGB1作为晚期炎症介质参与了脓毒症的病理生理过程。近年来的实验研究发现，在各种急性炎症条件下，HMGB1在细胞外或胞浆中的表达与肺炎、脓毒症、内毒素血症等急性炎症病情相关［６，７］。肝脏中有大量的巨噬细胞存在，急性肝损伤和肝衰竭时又往往并发内毒素血症，内毒素血症能诱导肝脏HMGB1表达增强［８］。HMGB1作为晚期炎症介质在脓毒症、内毒素血症等炎症反应的细胞因子中具有核心作用。赤芍是我国传统的活血化瘀类中药，有着悠久的用药, 它的药学功效被记录到《神农本草经》,具有清热凉血，散瘀止痛之功能，主要用于热入营血、斑疹吐衄、经闭瘕、跌打损伤、痛肿疮毒、目赤翳障等症［９］。芍药苷是赤芍的主要有效成分,大量的临床研究证实芍药苷有抗炎、抗溃疡、保肝、免疫调节等多方面的药理作用。然而，芍药苷是否能抑制HMGB1的表达和释放，对抗内毒素血症引起的肝损伤而发挥保护作用尚不清楚。本实验培养的RAW264.7细胞是小鼠腹腔巨噬细胞株，具有肝脏枯否细胞的功能，因此，实验结果能够反映肝损伤时枯否细胞机制变化。实验中，LPS刺激RAW264.7细胞20 h后，我们采用免疫组化法观察了巨噬细胞HMGB1的表达情况，结果显示：正常培养的小鼠腹腔巨噬细胞未刺激时HMGB1聚集在细胞核内，LPS刺激20 h后大部分细胞HMGB1从胞核转移到胞浆，细胞体积增大，伪足伸出，细胞核HMGB1特异性染色变淡，部分细胞胞核染色变蓝，胞浆染色加深。芍药苷组细胞体积改变不明显，大部分细胞HMGB1的释放被抑制，细胞核HMGB1特异性染色变深，胞浆染色变浅，表明芍药苷可以抑制HMGB1的核转位。

    最近研究表明，急性肝损伤时肝脏巨噬细胞受LPS刺激时HMGB1从胞核转移到胞浆是其释放的前提［１０］，结合本实验结果提示：芍药苷对内毒素诱导的肝损伤有保护作用，可能是通过抑制晚期炎症介质HMGB1的核转位和释放而发挥作用。本实验初步探讨了活血化淤类中药抗炎作用机制，为临床抗炎中药的开发提供理论依据。

【】
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［１０］ 张芸，赵中夫.LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究［Ｊ］.长治医学院学报,2008,22(4)245～247.