不同治法方药对脂肪肝大鼠肝组织NFκBp65及Kupffer细胞p38MAPK蛋白表达的影响

                作者：杨钦河，谢芳，王凤珍，凌家生，王强，程少冰，唐海兰，

             胡巢凤，王彦平，孙升云，金玲，周羽竝，陈万群，杨环文，张玉佩

【摘要】  　　【目的】探讨中医不同治法方药对脂肪肝大鼠肝组织核因子?κB(NF?κBp65)及Kupffer细胞p38MAPK蛋白活性的影响。【方法】选用SD大鼠98只，随机分为正常组、模型组、疏肝组(灌服3?2 g·kg-1·d-1剂量的柴胡疏肝散)、健脾组(灌服10?0 g·kg-1·d-1剂量的参苓白术散)、祛湿组(灌服3?5 g·kg-1·d-1剂量的平胃散)、活血组(灌服7?1 g·kg-1·d-1剂量的膈下逐瘀汤)、综合组(灌服11?9 g·kg-1·d-1剂量的自拟方);采用高脂饲料喂养、白酒灌胃法复制大鼠脂肪肝实验动物模型，给药12周后处死动物取肝组织，应用免疫组织化学法检测NF?κBp65在各组中的活性及组织病变化。同时每组取3只大鼠分离Kupffer细胞，应用Western blot法检测不同组别大鼠Kupffer细胞p38MAPK蛋白的表达及其磷酸化水平的变化。【结果】模型组大鼠肝组织NF?κBp65蛋白表达较正常组显著增加(P＜0?05)，疏肝组、健脾组NF?κBp65阳性表达最低、肝组织脂肪变最轻，与模型组比较差异有显著性意义(P<0?05)，且脂肪肝大鼠肝组织NF?κBp65表达强度与其病理学的改变呈正相关(P<0?01)。模型组大鼠Kupffer细胞p38MAPK蛋白表达和磷酸化p38MAPK蛋白表达较正常组显著增加(P<0?01)，各给药组p38MAPK蛋白表达和磷酸化p38MAPK蛋白表达均较模型组显著降低(P<0?01)，其中以健脾组、疏肝组下降最为明显。【结论】抑制NF?κBp65和p38MAPK蛋白及磷酸化p38MAPK蛋白表达可能是上述不同治法方药抗脂肪肝作用的机制之一。

【关键词】  脂肪肝／中药疗法；肝组织／病理学；疏肝；健脾；疾病模型，动物；大鼠

　　Effect of Different Therapies on Hepatic Nuclear Factor κBp65 and Kupffer Cell p38MAPK Expression in Rats with Fatty Liver

　　Abstract:  Objective To investigate the effect of different therapies on hepatic nuclear factor κBp65 (NF?κBp65) and Kuffer cell p38MAPK expression in rats with fatty liver. MethodsNinety?eight SD rats were randomized into 7 groups: normal group，model group，liver?soothing group (receiving gavage of Chaihu Shugan Powder 3?2 g·kg-1·d-1)，spleen?strengthening group (receiving gavage of Shen Ling Baizhu Powder 10?0 g·kg-1·d-1)，dampness?respelling group (receiving gavage of Pingwei Powder 3?5g·kg-1·d-1)，blood?activating group (receiving gavage of Gexia Zhuyu Decoction 7?1 g·kg-1·d-1) and the combination group (receiving gavage of selt?made prescription 11?9 g·kg-1·d-1). Except the normal group，the rats in other groups were fed with high?fat forage and wine to induce fatty liver. After treatment for 12 weeks，the rats were executed to obtain the liver. Immunohistochemical assay was used for the detection of hepatic NF?κBp65 activity and hepatic pathological changes. Kupffer cells were isolated from 3 rats of each group，and then the p38MAPK protein expression and phosphorylation p38MAPK level in Kupffer cells were detected by Western blot method. ResultsHepatic NF?κBp65 protein expression was increased in the model group (P＜0?05 compared with the model group)，the incidence of NF?κBp65 positive expression was the lowest and hepatic fatty changes were the slightest in liver?soothing group and spleen?strengthening group (P＜0?05 compared with the model group). The increase of hepatic NF?κBp65 expression in fatty liver rats was positively correlated with the hepatic pathological changes (P＜0?01). Kupffer cell p38MAPK protein expression and phosphorylation p38MAPK protein expression were increased in the model group (P＜0?01 compared with the normal group)，while were decreased in the medication groups (P＜0?01 compared with the model group)，in particular in spleen?strengthening group and liver?soothing group.Conclusion Inhibition of hepatic NF?κBp65 expression，and Kupffer cell p38MAPK protein expression and phosphorylation p38MAPK protein expression may be one of their therapeutic mechanisms of the above therapies for fatty liver.

　　Key words: FATTY LIVER/TCD therapy；LIVER/pathology;SOOTHING LIVER；STRENGTHENING SPLEEN；DISEASE MODELS，ANIMAL;RATS

　　近年来，随着人们生活方式和饮食结构的改变，脂肪肝的发生率急剧上升，而有效的防治手段却较为滞后。核因子?κB(nuclear factor kappa B,NF?κB)与肝脏的炎症、纤维化等发生有密切关系，Kupffer细胞免疫相关信号通路的变化，在脂肪肝的发生机制中亦发挥着重要作用［1-4］。本实验采用疏肝、健脾、活血、祛湿等中医不同治法方药对脂肪肝模型大鼠进行干预，探讨其对脂肪肝大鼠肝组织NF?κBp65和Kupffer细胞p38MAPK蛋白活性的影响，初步提示不同治法方药防治脂肪肝的作用效果及其机制。现报道如下。

　　1材料与方法

　　1?1动物分组及模型

　　建立SPF级SD大鼠98只，购于广东省实验动物中心［实验动物合格证：SCXK（粤）2003?0002，粤监证字2005A010号］，雌雄各半，体质量（200±20）g。分笼饲养于室温22℃~26℃、明暗各12h的室内。大鼠正常喂养1周后按体质量随机分为7组，每组14只，雌雄各半，分别为正常组、模型组、疏肝组、健脾组、祛湿组、活血组、综合组。正常组以基础饲料喂养，其他各组大鼠按［5］方法制备高脂饲料喂养，同时以10mL/kg剂量灌服体积分数55%红星二锅头白酒，每天上午1次。各组大鼠均自由饮水、进食，连续12周。

　　1?2主要试剂及仪器

　　Mycodenz为Axis?Shield公司产品；IV型胶原酶、RPMI?1640培养基为Gibico公司产品；蛋白酶E为Roche公司产品；Hepes为Amresco公司产品；DNA酶 Ⅰ、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）为Sigma公司产品；新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产；兔抗人溶菌酶抗体购于福州迈新生物技术有限公司；免疫组织化学P物质（SP）法试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司；兔抗大鼠磷酸化p38MAPK单克隆抗体、兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗体、山羊抗兔辣根过氧化物酶标抗体、抗生物素辣根过氧化物酶标抗体、Lumiglo、Peroxide均为Cell Signaling Technolgy产品；NF?κBp65小鼠抗大鼠单克隆抗体（产品编号为SC8008）、抗原修复所用胰酶及二抗试剂盒均为北京中杉公司产品。

　　1?3给药方法

　　各给药组大鼠在施以造模因素的同时，按10mL/kg给予相应剂量的药物，正常组和模型组给予等容积蒸馏水灌胃，每天下午1次。中药均购于暨南大学第一附属中药房，为三九医药颗粒剂。除综合方为多法联用方外，其他各方组成、剂量均参照《方剂学》［6］教材。给药剂量按人和动物体表面积折算，其中综合组以自拟方（白术、泽泻、柴胡、山楂、丹参、大黄等）灌服（含生药量1?19g/mL），疏肝组灌服柴胡疏肝散（含生药量0?32g/mL），健脾组灌服参苓白术散（含生药量1?00g/mL），祛湿组灌服平胃散（含生药量0?35g/mL）,活血组灌服隔下逐瘀汤（含生药量0?71g/mL），连续12周。

　　1?4标本采取及实验方法

　　1?4?1标本采取各组实验鼠于末次给药后，禁食不禁水12h，每组取3只大鼠分离、提取Kupffer细胞。其他各实验鼠以30mg/L戊巴比妥钠（1mL/kg）腹腔注射麻醉后，迅速摘取肝脏，取距离肝边缘0?5cm处相同部位肝右叶约2cm×2cm×0?3cm；以体积分数10%甲醛固定标本，常规石蜡包埋，作5μm连续切片，分别作苏木素—伊红（HE）和免疫组化染色。

　　1?4?2肝Kupffer细胞的分离文献［7］并作改进。以37℃含0?5mmol/LEGTA的D?hanks液约200mL,400mL/min经门静脉灌注，当肝脏表面颜色变成淡黄色时取下肝脏，放入玻璃培养皿中。再以含0?5mg/LIV型胶原酶的Hanks液（含钙离子5mmol/L,预热37℃）50mL，20mL/min循环灌注20~30min。将肝脏除去包膜及纤维组织，放入含1mg/L蛋白酶E的颗粒结合型淀粉合酶（GBSS）液中37℃振摇孵育60min。200目筛网过滤后以350r/min离心10min。弃上清，取沉淀。加入含DNA酶Ⅰ的GBSS液，350r/min离心2次，每次5min。Nycodenz工作液的浓度分别为体积分数16%和10?8%。取10mL离心管若干支，仔细将Nycodenz梯度液铺层：底层为16%Nycodez,密度1?080；中层为10?8%Nycodez，密度1?058；顶层为细胞悬液。三者体积比为1：1：1，铺层时，应保证每层之间的界面清晰，避免混淆。放入悬垂式冷冻离心机，1000r/min离心30min，取出离心管，离心后液体分层，在1?058和1?080密度界面上可见细胞层面。此层面即富含Kupffer细胞，用尖吸管将细胞吸出，尽量少带梯度液，移入另一试管（50mL）中。梯度离心后获得的细胞悬液，加入含DNA酶Ⅰ的GBSS液，350r/min离心3次，每次5min。细胞置于含有1640培养液的培养皿中贴壁30min 后，弃去培养液，以溶菌酶免疫细胞化学方法鉴定Kupffer细胞，细胞接种密度约3?5×106/mL，台盼蓝拒染鉴定细胞活力。

　　1?4?3免疫组化染色法免疫组化染色应用SP法，具体步骤如下：石蜡切片常规脱蜡至水；蒸馏水清洗，应用稀释胰酶液37℃、10min行抗原修复；体积分数3%H2O2室温10min;滴加山羊血清室温10min后倾去不洗；滴加一抗，将标本置于湿盒4℃冰箱过夜；滴加生物素化二抗工作液，室温15min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液（HRP），室温10min;显色剂联苯二胺（DAB）显色（镜下观察并及时阻断）；自来水冲洗，轻微复染后常规脱水封片。以上染色各步均需用pH7?4磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次×5min。选择肝癌组织作为阳性对照，阴性对照选择PBS液代替一抗。

　　1?4?4Western blot方法检测p38MAPK及磷酸化p38MAPK蛋白活性加细胞裂解液（20mmol/LTris?HCl、150mmol/LNaCl、1mmol/LNa2EDTA、1mmol/L EGTA、10mg/LTriton、2?5mmol/L焦磷酸钠、1mmol/Lβ?磷酸甘油、1mmol/LNa3VO4、1μg/mL  Ieupeption）于分离提取的Kupffer细胞中，冰上裂解30min，用细胞刮刮下，将其吸取置于EP管中，4℃、13000r/min离心30min×2次，均取上清液，置于-80℃冰箱中保存。以紫外分光光度计测定蛋白浓度，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS?PAGE）法，每孔加样蛋白浓度为20μg。电泳结束后取出凝胶，将其转移至硝酸纤维素（PVDF）膜上，以50g/L脱脂奶粉封闭；与一抗（p38MAPK兔多克隆抗体，稀释比1：1000，稀释液为50g/L脱脂奶粉）室温孵育2h；加二抗（Anti?rabbit IgG,HRP?linked;HRP?conjugated anti?biotin antibody,稀释比均为1：1000，稀释液为50g/L脱脂奶粉）室温孵育2h。将膜放入Lumiglo和Peroxide配制的显色液中，室温1min。取出膜，于暗室中与X光片一起曝光并显影、定影。最后用Dolphin?SCAN扫描，Dolphin ID软件分析结果，以相对于正常组的D值代表蛋白的相对表达量。同样的方法检测p38MAPK蛋白磷酸化水平，一抗为磷酸化p38MAPK兔单克隆抗体。

　　1?5判断标准

　　1?5?1脂肪性肝炎炎症活动度计分［8-9］具体计分标准见表1。表1炎症活动度计分标准（略）

　　1?5?2肝脏组织病变化肝细胞脂肪变性程度判断标准见表2。表2肝细胞脂肪变性程度判断标准（略）

　　1?5?3NF?κBp65表达按阳性细胞所占百分比，并结合染色强度作适当调整进行半定量分析。即：高倍镜下取10个不同视野，每个视野计数100个细胞，取其平均值。结合本次实验情况，根据阳性细胞的百分比与染色强度，参照许良中等［10］制订的判断标准，先将染色强度打分，0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再将阳性细胞所占的百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞＜5%,2分为阳性细胞占5%~25%，3分为阳性细胞占25%~50%，4分为阳性细胞＞50%。染色强度与阳性细胞百分分值的乘积0分为阴性，＞3分为表达阳性，＞6分为强阳性。由此根据阴性、阳性进行χ2检验，再将NF?κBp65表达强度与病理分级进行等级相关分析。

　　1?6统计学方法

　　采用SPSS11?0软件包进行数据分析，计量资料组间比较用方差分析，等级资料用秩和检验，NF?κBp65阳性率比较用χ2检验及Fisher?s确切概率检验；肝组织脂肪变性程度与NF?κBp65阳性表达的相关性用χ2检验相关分析。

　　2结果

　　2?1各组光镜观察结果

　　正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐，肝血窦正常，肝细胞无明显病变，核结构清晰。模型组大鼠肝细胞增大，胞浆内脂滴大小不一，呈中至重度肝细胞脂肪变性，细胞水肿严重。模型组与正常组比较脂肪变程度差异有显著性意义（P＜0?05）。综合组、祛湿组、活血组大鼠肝组织脂肪变程度较模型组有不同程度减轻，但差异无显著性意义（P＞0?05）。结果见表3、图1（彩图见第199页）。
表3各组大鼠肝细胞脂肪变程度比较（略）

　　模型组大鼠小叶内炎症较明显，炎症细胞主要以单个核细胞为主，点状或小灶性，部分大鼠可见数个炎症坏死灶融合成片，汇管区亦可见到以单个核细胞为主的炎症细胞浸润，但程度较小叶内轻，未出现碎屑样坏死和桥接坏死。正常组、疏肝组和健脾组炎症活动计分显著低于模型组（P＜0?05）；其他各用药组炎症计分情况与模型组比较差异无显著性意义（P＞0?05）。提示模型组大鼠脂肪性肝炎明显，疏肝和健脾方药对脂肪性肝炎的炎症活动有明显的抑制作用。结果见表4、表5。表4炎症活动度分级表（略）表5各组炎症计分表（略）

　　2?2免疫组化结果正常组大鼠肝组织NF?κB p65表达最弱，阳性表达率最低（11?1%）。模型组肝组织NF?κBp65表达最强，阳性表达率最高（80?0%），主要分布在中央静脉旁、脂滴集中处及肝索排列紊乱处。各组NF?κBp65表达强度依次为模型组＞祛湿组＞活血组＞综合组＞健脾组＞疏肝组＞正常组。模型组与正常组比较差异有显著性意义（P＜0?05）。疏肝组及健脾组与模型组比较差异有显著性意义（P＜0?05）。其他各用药组NF?κBp65表达与模型组比较虽有降低，但差异无显著性意义（P＞0?05），提示疏肝和健脾方药对脂肪肝模型大鼠肝组织NF?κBp65表达有显著抑制作用。结果见表6、图2（彩图见第199页）。表6各组NF?κBp65的表达比较（略）

　　2?3NF?κBp65表达与病理分级的关系

　　χ2检验相关分析表明，NF?κBp65在脂肪肝模型大鼠中的表达强度与其病理分级存在正相关（P＜0?01），提示肝组织脂肪变性越严重则NF?κBp65表达越强。结果见表7。
表7病理检查肝组织脂肪变性程度与NFκBp65表达的相关性（略）

　　2?4各组Kupffer细胞的数量、纯度及活性Kupffer细胞获得率

　　正常组约为3×106~4×106个/肝，其他各组均在1×107个/肝以上。最终获得的Kupffer细胞经台盼蓝染色行细胞活性鉴定，结果活性细胞占95%。采用大鼠兔抗人溶菌酶抗体免疫组织化学方法鉴定Kupffer细胞纯度大于90%。初分离得到的Kupffer细胞在倒置相差显微镜下呈折光很强的圆球形，48h后大部分细胞伸展生长，细胞大小不一，形态多样，呈星形、多角形、十字形等不规则形态。

　　2?5各组Kupffer细胞p38MAPK蛋白及磷酸化p38MAPK蛋白表达变化比较

　　正常组Kupffer细胞内有一定数量的p38MAPK蛋白表达，高脂饲料及酒精灌胃刺激后，p38MAPK蛋白表达均有所增高，各组光密度值较正常组基础值分别增加了5?77、1?47、3?35、4?03、3?40、4?28倍，结果见图3、图4。高脂饲料及酒精刺激后，模型组大鼠Kupffer细胞p38MAPK蛋白被显著磷酸化，较基础值增加17?54倍；各给药组干预后，大鼠Kupffer细胞p38MAPK蛋白磷酸化水平显著下降（均P＜0?01），其中健脾组、疏肝组大鼠Kupffer细胞p38MAPK蛋白磷酸化水平下降更为显著，结果见图5、图6。

　　3讨论
 
　　脂肪肝的发生、和形成是机体多系统、多环节、多因素共同作用的结果。无论是酒精性脂肪性肝病(AFLD)还是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），其发病机制主要与氧应激及脂质过氧化损伤、内毒素(LPS)血症、细胞因子(cytokine，CK)释放增多、胰岛素抵抗(IR)、游离脂肪酸(FFA)增加、酒精损害、免疫异常、缺血及肝循环障碍等多种病理生理改变有关，各种因素交互作用致使脂肪代谢发生障碍，脂质在肝内大量蓄积而导致脂肪肝的发生和发展。但脂肪肝的确切发病机理至今尚未阐明。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen?activated protein kinase，MAPKs)是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝／苏氨酸蛋白激酶，参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤及其他多种疾病的发生发展密切相关。p38MAPK是控制炎症反应最主要的MAPKs家族成员之一，能够促进白细胞的聚集和活化，调节转录因子的活性及细胞因子的合成，对炎症反应的调控起着关键性的作用，它参与NF?κB、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）等众多炎症因子的调控，并与这些炎症因子形成正反馈调节作用，使炎症反应不断扩大和加重，p38MAPK也是参与脂肪肝形成的重要信号通路之一。鉴于p38MAPK信号转导通路在脂肪性肝炎发病机制中的重要作用，因此，把p38MAPK作为抗炎的一个靶点，不断开发新型高效的p38MAPK阻断剂，将为脂肪性肝炎的防治提供新的方法和手段［11-13］。NF?κB是一种广泛存在于真核生物细胞浆中，激活后进入细胞核与相应靶基因结合的核转录因子，能够介导各类炎性介质表达，引发炎症反应等，包含p65(RelA)、p50／105c?Rel、p52/100及RelB等亚单位结构，而p65表达最为广泛且生物活性最强［1，14］。本研结果表明，正常组大鼠肝组织NF?κBp65及Kupffer细胞p38MAPK和磷酸化p38MAPK蛋白表达较弱，而模型组大鼠肝组织NF?κBp65及Kupffer细胞p38MAPK和磷酸化p38MAPK蛋白表达较正常组显著增加（P＜0?05或P＜0?01），疏肝组、健脾组NF?κBp65阳性表达最低、肝组织脂肪变最轻，与模型组比较差异有显著性意义(P<0?05)，且脂肪肝大鼠肝组织NF?κBp65表达强度与其病理学的改变呈正相关（P＜0?01）。各给药组p38MAPK蛋白表达和磷酸化p38MAPK蛋白表达均较模型组显著降低(P<0?01)，其中以健脾组、疏肝组下降最为显著，提示疏肝、健脾治法及方药均可较好地抑制大鼠肝组织NF?κBp65蛋白、Kupffer细胞p38MAPK蛋白和磷酸化p38MAPK蛋白的表达及肝组织脂肪变。因此，大鼠肝组织NF?κBp65蛋白及Kupffer细胞p38MAPK蛋白和磷酸化p38MAPK蛋白过度表达可能是脂肪肝发生的机制之一；肝郁脾虚可能是所造大鼠脂肪肝模型的主要病机，疏肝、健脾治法及方药在脂肪肝防治中可能具有重要的作用和地位；大鼠肝组织NF?κBp65和Kupffer细胞p38MAPK蛋白可能是上述治法方药发挥作用的重要靶点之一。   

　　研究表明，p38MAPK与NF?κB是炎症时细胞信号转导和基因调控中重要的两条通路，各自既有相对独立的信号通路，又存在着复杂的相互交汇作用，在脂肪性肝炎的发生发展中发挥着重要的作用［15-17］。但NF?κB与p38MAPK之间的关系目前尚不十分清楚，因此，从p38MAPK与NF?κB之间的关系入手，积极深入地探讨疏肝、健脾治法及方药防治脂肪肝的作用机制具有重要的意义。

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