结缔组织核心蛋白聚糖基因在结肠癌组织中转录水平表达的研究

                         作者：宋操 海萍 高申 张桂珍

【摘要】  目的:观察Decorin mRNA在结肠癌组织中的表达，探讨Decorin表达与结肠癌的关系。方法:临床手术切除新鲜结肠癌组织石蜡切片，应用原为杂交技术检测Decorin基因转录水平的表达。结果:结肠癌组织中与相对正常结肠组织中均可见Decorin mRNA表达，但两者之间的表达未见统计学差异（P>0.05）。结论:探索Decorin转录水平表达与结肠癌发生的关系，只应建立在大样本观察基础上进一步作深入的研究。

【关键词】  核心蛋白聚糖（Decorin）;结肠癌;原位杂交

　　为了探讨结缔组织核心蛋白聚糖（Decorin）与大肠癌发生发展的关系，本研究选择临床手术切除的新鲜结、直肠癌组织标本，应用原位杂交与从基因转录水平研究了Decorin在大肠癌组织中的表达。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 临床资料

　　2003年3月～8月间吉林大学中日联谊手术切除结直肠癌标本10例，其中男性6例，女性4例，年龄37～64岁，平均年龄51.2岁。手术后病理组织类型为管状腺癌8例，乳头状腺癌2例。分化程度中、高分化腺癌7例，低、未分化腺癌3例。按Duke's分期A级1例，B级7例，C级2例。手术切除远离结直肠癌的相对正常大肠组织标本9例，迅速固定4%多聚甲醛24hr，石蜡包埋。
　　1.2 实验方法
   
　　1.2.1 原位杂交方法

　　原位杂交探针针对人Decorin靶基因的mRNA序列为:（1）5'-ATGGA AATCA GA-CAG TACCT GGCAC AGTGG-3';（2）5'-AAGTT GAGAC TGTTG GTGAA ATTGC AAGAG-3';（3）5'-CCTTC TAGAC TTCAG ACCAC AGACA ACCTG-3'。

    杂交程序:石蜡包埋切片厚度4μm，58℃烤片30min，常规脱蜡至水;3%H2 O2 灭活内源性过氧化物酶，室温10min，DEPC水洗3次;切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化20min;原位杂交PBS洗5min×3次，DEPC水洗涤1次;1%多聚甲醛.0.1M PBS，含有1.1000DEPC后固定，室温10min，DEPC水洗3次;预杂交恒温38℃，2hr;恒温箱38℃杂交过夜。37℃2×SSC洗涤5min×2次;37℃0.5×SSC洗涤15min×1次，37℃0.2×SSC洗涤15min×2次;滴加封闭液，37℃30min;滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃60min，PBS洗5min×4次;滴加SABC，37℃20min，PBS洗5min×3次。滴加生物素化过氧化物酶，37℃20min，PBS洗5min×4次;DAB显色20min，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明封片。
   
　　1.2.2 原位杂交结果判定标准

　　参照Fromowitz方法［1］，Decorin蛋白表达以细胞核或细胞胞浆内有棕黄色颗粒为阳性。随机观察5个中倍镜下视野，每个视野计数100个细胞，算出各个视野中阳性细胞数的平均百分比进行计分。0%～5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，大于75%计为4分;染色强度则以阳性细胞呈现的染色特征为标准进行计分:细胞未染色计为0分，染色呈淡黄色计为1分，棕黄色计为2分，棕褐色计为3分;然后根据两者相加所得的总分进行结果判定。0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（+），4～5分为中度阳性（），6～7分为强阳性（）。
   
　　1.2.3 统计分析

　　SAS8.0统计软件进行Fisher精确概率及t检验。
    
　　2 结果
    
　　Decorin mRNA在结直肠癌中的表达，结直肠癌癌细胞及相对正常大肠腺细胞内均可见Decorin mRNA表达（图略）。其中相对正常大肠腺细胞Decorin mR-NA表达阳性率为100%，以胞核表达为主，胞核表达阳性率为66.67%，胞浆表达阳性率为33.33%。而结直肠癌癌细胞Decorin mRNA表达阳性率为60%（6/10），且均为胞浆表达。结直肠癌及相对正常大肠腺细胞Decorin mRNA阳性信号染色强度均较弱。虽然Decorin mRNA在相对正常大肠中表达阳性率高于结直肠癌，但其差别无显著性（P>0.05）。见表1。 表1 Decorin mRNA在结直肠癌及相对正常大肠中的表达
     组 织 n 总阳性（%） 阳 性 分 型胞核（%）胞浆（%）相对正常大肠 9 9（100） 6（66.67）3（33.33）结直肠癌 10 6（60） 0（0） 6（60）P值 >0.05

　　本实验结直肠癌两种肿瘤组织中Decorin表达的研究证实，Decorin在不同肿瘤组织中的表达是多样的、复杂的。实验结果在结直肠癌癌细胞及相对正常大肠均可见Decorin mRNA表达，在相对正常大肠中Decorin mRNA表达阳性率高于结直肠癌，但其差异无显著性（P>0.05）;本实验在对结直肠癌组织中Decorin表达的研究中虽然发现结直肠癌癌细胞中有Decorin mRNA表达，但未见Decorin蛋白表达。Decor-in在肿瘤组织及肿瘤细胞中的多样化表达表明其在肿瘤发生、中的作用是复杂的。早期研究认为Decorin表达增加，利于肿瘤发生、发展，认为Decorin的合成受到肿瘤细胞调控，肿瘤细胞通过控制自身微环境变化，进而展现浸润性生长及转移特性。近年来研究普遍倾向于认为Decorin可抑制肿瘤生长，Decor-in表达减少，利于肿瘤发生、浸润、转移。

    本研究同时也作了Decorin免疫组化，但未发现有蛋白的表达，也就是说Decorin mRNA表达水平与其蛋白表达不完全一致。国外一些研究也同样发现在某些组织中虽然有Decorin mRNA表达，但相应Decorin蛋白表达却很少或缺如。Leygue E等［2］在研究Decorin在乳腺癌中的表达时发现用免疫组化与Western blot方法检测Decorin蛋白表达，不如用原位杂交方法检测Decorin mRNA表达显著。相关研究显示SLRPs家族中其他成员同样存在mRNA与蛋白表达的差异。在正常的腱组织中可见aggrecan和versi-can的mRNA和蛋白表达水平不一致［2］。Decorin和iglycan在正常和反应性胃粘膜中mRNA与蛋白质定位不同［3］。在血管周围的软骨基质及长骨的生发区同样可见Decorin和biglycan的mRNA与蛋白质的定位不同［4］。
   
　　组织中Decorin mRNA与蛋白表达水平不一致，其原因可能是组织中Decorin mRNA表达和蛋白表达本身是不尽相同的。组织中可能存在Decorin mRNA转录但蛋白质翻译减少或缺如。其次，这种蛋白质和mRNA表达水平不同，可能是因为蛋白质合成和分解速度不同。研究发现上皮细胞在生长因子如bFGF刺激下，biglycan不仅转录、蛋白质合成增加，其相应蛋白水解率也增加。蛋白质翻译减少或降解增多均可导致组织中Decorin蛋白表达减收或缺如;最后，可能是因为天然蛋白形成中的折叠或者翻译后修饰变化，或者是与组织中其它蛋白结合，导致Decorin抗原表位被遮盖，故检测不到Decorin蛋白表达［5～8］。本研究在结直肠癌癌细胞及相对正常大肠组织均见Decorin mRNA表达，但两者之间的表达差异不明显，仍需扩大样本量系统深入研究，有利于发现性的变化。
 

【】
  　　［1］Fromowitz FB，Viola MV，chao S，et al.Res p21expression in the progression of breast cancer［J］.Humpathol，1987，18:1268-1275.

［2］Leygue E，Snell L，Dotzlaw H，et al.Expression of lumican in human breast carcinoma［J］.Cancer Res，1998，58（7）:1348-52.

［3］Waggett AD，Ralphs JR，Kwan AP，et al.Characterization of collagens and proteoglycans at the insertion of the human Achilles tendon［J］.Matrix Biol，1998，16（8）:457-70.

［4］Schonherr E，Lugering N，Stoll R，et al.Differences in Decorin and biglycan expression in patients with gastric ulcer healing. Scand J Gastrocnterol，1997，32（8）:785-90.

　　［5］Bianco P，Fisher LW，Young MF，et al.Expression and local-ization of the two small proteoglycans biglycan and Decorin in de-veloping human skeletal and non-skeletal tissues［J］.J Histo-chem Cytochem，1990，38（11）:1549-63.

　　［6］宋，操海萍，郑德明，等.Decorin mRNA在乳腺癌组织中表达的观察［J］.长春中医药大学学报，2007，23（1）:23-24.

［7］曹茂开，赵文明，侯云德.饰胶蛋白（Decorin）基因的cDNA克隆与表达［J］.西安医科大学学报，2000，21（6）:512-514.

　　［8］王慧群，张志刚，陈广平，等.稳定表达饰胶蛋白聚糖基因的大鼠肾小球系膜细胞株的建立［J］.复旦学报（医学版），2001，28（2）:97-99.