新生儿缺氧缺血性脑病动物模型的建立

【关键词】  新生儿 缺氧缺血性脑病 动物模型

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic?ischemic encephalopathy, HIE）是指由于围产期窒息缺氧导致脑的缺氧缺血性损伤，患儿生后出现一系列神经系统后遗症的表现。如果不经过积极正规的，患儿的死亡率高，存活者常留下或轻或重的神经后遗症。HIE不仅严重威胁着新生儿生命健康，并且是国内外伤残儿童重要病因之一，给家庭和社会带来了沉重的负担［1］。在国内外围产医学界中，至今对HIE缺乏安全有效的治疗方法，特别是对传统常用药物如苯巴比妥钠、地塞米松及甘露醇等，国外严格的对照研究发现，这些药物对脑损害及预后的改善并不理想，这主要是因为新生儿大脑与成人大脑在发育和功能等方面存在有巨大的差异［2］，对成人安全有效的药物并不一定适用于新生儿。由于近年来对HIE发病机制的研究取得很多进展，因此，根据发病机制去寻求改善脑损害的药物一直是国内外围产医学领域的重要课题。HIE发病机制和合理用药的实验研究基于动物实验，要力寻解决HIE治疗难题的途径，首先要涉及HIE模型的制备。长期以来，围绕着如何建立一种适用有效的HIE动物模型的问题，国内外医学工作者做了长期大量的研究工作。

    1  模型动物的选择

    缺氧缺血造成的脑损伤在不成熟的大鼠、兔、绵羊及猴等实验动物模型中得到证明，这些模型也已经提供了大量重要的信息，不仅阐明了组织损伤的病理和生理机制，而且为各种特殊治疗策略的有效性提供了有力的证据。因此，在动物实验研究中，常以缺氧缺血性脑损伤新生动物作为研究对象。Yager 等［3］曾在2004年作过统计，在200多种新生儿HIE相关动物实验中，大鼠应用最广泛（29%），接着是猪（25%）和羊（20%）。在这些动物模型中，胚胎期或新生的恒河猴和未成熟的大鼠被研究应用得最广泛，因为这两种新生动物在神经解剖及生理复制等方面与人类最为接近，其中新生大鼠优势更多，如容易获取，母鼠孕期短、繁殖快，1窝可生8～15只，费用低，有利于实验条件的控制，而新生猪、猴、羊等来源较困难，死亡率高，费用高。因此，长期以来，国内外医学工作者常把新生大鼠作为研究新生儿HIE的首选实验动物。

    2  模型动物年龄的选择

    用于新生儿HIE实验的模型动物有很多，我们以应用最多的新生大鼠为例。不同年龄的大鼠其大脑发育程度是不一样的，研究发现，新生7 d大鼠的中枢神经系统是不成熟的，其发育程度类似于孕32～34周的人类胎儿或新生儿［4］，大脑皮层的神经分层完整，生发机制退化，白质也已有少量髓鞘形成，其能量代谢、神经递质、血流动力学、蛋白质代谢以及免疫炎性改变等均能被很好地加以特征化［5］，其继发能量衰竭及脑电图类型与严重窒息新生儿的临床发现相似，这对于评价神经保护药物的短期和长期疗效尤为重要。因此长期以来，研究者大多采用新生7 d的大鼠作为新生儿HIE模型动物。随着研究的深入，超低龄大鼠（如生后1～2 d大鼠）也被用于试验中，并且揭示出极度不成熟大脑在损伤易感性上有重要的差异，这为新生儿HIE的研究开辟了一条新的途径。和新生7 d大鼠相比，超低龄大鼠的脑损伤要求更长时间和更严重程度的缺氧，而随之产生的同侧脑皮质下白质损伤也更加严重，主要是少突胶质细胞的始祖细胞的死亡，这种神经细胞虽然是过渡性的，却起着非常重要的作用，它的过早死亡也许能更好地解释在许多早产儿中普遍存在的神经系统发育异常以及单一的脑白质损伤现象。

    3  模型动物的诱导方法

    建立动物模型的过程应该尽量与新生儿HIE发病过程相似，这样才能更好地模拟新生儿HIE的发生。单纯缺氧或单纯缺血或缺氧伴缺血是诱导缺氧缺血性脑损伤常用的方法，这些方法在某些研究细节上有着明显的差别。长期以来，国内外采用的新生儿HIE动物模型的诱导方法主要有：

    3.1  经典法

    该法由Vannucci于1981年在Levine的成年大鼠缺氧缺血性脑损伤模型基础上经过改进而建成，至今二十多年在全世界被广泛应用。其具体操作方法如下：生后7 d大鼠麻醉后行左颈总动脉结扎术，术后恢复4～8 h后置于氧浓度为8%、环境温度为37 ℃的密闭容器内持续缺氧3.5 h。该法具有不少优点，譬如容易实施，在血流变化以及细胞代谢紊乱等方面与出生时窒息情况很相似，花费不多就能提供长时程的神经病理性损害及功能的评估，还能用大量的动物做出保护性试剂的剂量反应性评价等。使用该方法，大脑损伤通常局限于颈总动脉结扎那一侧的大脑半球，随着缺氧持续时间的不同，出现选择性神经元死亡和梗塞，在大脑皮质、海马、纹状体及丘脑都能看见组织损伤，皮质下及脑室周围白质的损伤也能被观察到［6］。这种模型已被证实在缺氧缺血性脑损伤对运动能力、行为、癫痫发作、大脑成熟过程及其他机制的短期和长期影响的研究上是非常有用的。最近，随着大脑缺氧缺血分子生物改变的确定，该模型已被用于基因改变的未成年大鼠的特殊研究。

    3.2  局部短暂脑缺血及再灌注法

    该法由S. Renolleau等建立，多年来已由Sola等人多次改进［7］，基本操作如下：新生7 d大鼠麻醉后电凝左侧大脑中动脉，再用夹子夹闭左侧颈总动脉1 h造成大脑局部缺血，1 h后去除夹子，使左颈总动脉再通，从而诱导再灌注形成。最近的研究表明，这类模型在脑缺血的不同时段其再灌注程度是不一样的。在缺血后期，大量脑细胞内出现严重酸中毒及ATP完全消失的现象，缺血后脑皮质血流量很快下降到脑缺血前11%的水平。再灌注过程中，细胞内的ATP及pH值在3 h内都能恢复，颈动脉血流量也能恢复。该模型的诱导过程与新生儿HIE的发病过程相似［8?11］，主要用于研究暂时性缺血诱导的单纯缺血（没有缺氧）及再灌注后半胱氨酸天冬氨酸酶对新生鼠大脑的影响和半胱氨酸天冬氨酸酶抑制剂对新生儿HIE是否具有潜在治疗作用。在临床上，随着新生儿重症监护的加强，脑的缺血再灌注损伤经常发生于新生儿HIE的抢救治疗过程中，而该模型成功诱导新生7 d大鼠产生了脑缺血再灌注过程。此外，通过闭塞局部脑血管也能更好地界定脑梗塞范围。

    3.3  宫内缺氧缺血法

    多年以来，在新生儿HIE研究中最大的不足就是对宫内缺氧缺血所致脑损伤不能进行准确真实的描述，而宫内缺氧缺血正是新生儿HIE重要病因之一。最近几年，国内外医学工作者正在逐步弥补这种不足，应用最多的宫内缺氧缺血模型有两种：一种是诱导孕羊患上低氧血症［12］；另一种是结扎孕羊脐带［13］，从而造成胎羊宫内缺氧缺血性脑损伤。研究者应用这两种模型，获取了丰富的神经生相关资料，但这两种模型仍然有很大缺陷：（1）孕羊体型大，价格昂贵；（2）能确证受累胎羊脑损伤的可靠依据很少，从而不能对受累胎羊随后的神经行为学后果进行测试。最近，一种新的模型极大的弥补了上述模型的不足，即用足月胎兔替代胎羊，这种新的模型能模拟急性胎盘供血不足所致的新生儿HIE，通过该法存活的新生兔明显显示出由于脑损伤所致的持久的肌张力过高和运动行为缺陷等。

    同类的实验模型还有： 脑室周围白质软化模型［14］以及可同时造成神经元丢失和脑室周围白质软化模型等［15］，研究者可根据不同的目的和需要酌情选择适用的模型。

    4  尚需解决的问题

    在多年以来的HIE动物模型研究过程中，仍然存在着不少尚未解决的问题，譬如经典法模型就存在以下问题：第一，新生儿HIE患者全身各个系统均遭受不同程度缺氧缺血打击，而该模型只结扎一侧颈总动脉，仅引起单侧大脑病变，而不能使全脑及全身其他系统一同受损，因此不能造成临床上严重窒息后经常引起的多器官损伤，也不易建立足月儿常见的旁矢状窦区损伤和早产儿多见的脑室周围白质软化的损伤。由此看来，该模型病变分布与新生儿HIE并不完全一致。第二，在临床上，缺氧窒息是新生儿HIE发病的核心，且大多源于胎儿宫内窘迫及新生儿窒息，缺氧往往同时伴有缺血的存在，两者没有截然分开。而该法是通过先结扎单侧颈总动脉造成缺血，然后再通过持续吸入低浓度氧造成缺氧，从而将缺氧缺血两个过程先后分开，这与临床上不一致。第三，该法采用的是逐只麻醉后进行手术，如果要同时进行大批量的模型研究就显得力所不及，且麻醉和手术必然会增加各种人为、外界环境因素对模型动物损伤程度的影响，从而造成各模型动物在损伤程度上的不一致。第四，该法不能进行心血管监测和反复抽取血样。此外，大鼠为平脑动物，不似人脑呈多脑回，大鼠脑损伤后也不像临床上新生儿脑损伤的程度和类型常呈多样化等。

    其他模型也存在有很多不足。Yang等［16］做过统计，从1955年至2004年，在对新生儿HIE动物模型的研究中，其中关于缺氧缺血后对中枢神经系统影响的各种测试多在损伤后1 h内进行，只有39%的实验在脑损伤24 h后对各种指标进行测试，大多数的研究都以急性的中枢神经系统代谢终点作为评估指标，而只有少量研究对临床的神经学行为后果以及神经病理学作出评估。迄今为止，还没有一种理想的动物模型被认为对所有的新生儿HIE研究适用。虽然有些模型在某些方面明显优于其他模型，但这取决于它所特定的研究问题，譬如胎羊及新生羊羔和新生猪适用于急性及亚急性的生理和代谢机制的研究，而齿鼠类和灵长类动物经常被用于长期的神经病理学及行为学后果的试验研究中。

    5  期望

    随着时间的推移和研究的深入，各种HIE动物模型也处于不断的改进之中，譬如各种新技术新方法的使用（如采用外科显微镜来做各种结扎手术），诱导脑损伤过程中缺氧缺血时间和程度也不断在变化等。随着基因技术的迅速，各种转基因动物也在该试验研究中被大量使用。最近在研究中最显著的发现就是：新生动物在缺氧缺血性脑损伤过程中，其易感性和病变严重程度存在着很大的种属差异性［17］。为了更好地检验用于新生儿HIE的各种药物的有效性和安全性，需要建立一种HIE动物模型统一的研究设计标准，通过这种标准能产生一种使缺氧缺血性脑损伤具有一致性和可预测性的统一方法。此外，建立一种能有效评估缺氧缺血性脑损伤后长时程的神经发育和行为结果的模型也很有必要。

【】
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