轻度认知功能障碍大鼠模型的制备及学习记忆能力的改变

【摘要】  　目的 建立轻度认知功能障碍(MCI)大鼠模型，并观察轻度认知功能障碍大鼠学习记忆能力的变化。方法 选取Wistar大鼠48只,将其随机分为4组,分别为正常对照组、MCI模型组、针刺百会组、针刺非经穴组,每组12只。采用周振华等研制的重度颈动脉狭窄所致认知功能障碍的大鼠模型并加以改进,造模后并采用电针,应用Morris水迷宫观察造模前后及治疗后大鼠认知功能的变化。结果 造模后与正常对照组比较，MCI模型组、针刺百会组及针刺非经穴组大鼠其潜伏期明显延长，呈显著性差异(P<0.05),穿越平台的次数减少(P<0.05),提示结扎双侧颈动脉可对大鼠学习记忆能力造成了影响。结论 结扎双侧颈动脉可导致轻度认知功能障碍，对大鼠的学习记忆能力造成了影响。

【关键词】  轻度认知功能障碍；颈总动脉;结扎；大鼠；学习记忆能力

　轻度认知功能障碍(MCI)是介于正常老化和痴呆之间的一种临床状态,与老年痴呆(AD)有相似的病理生理过程，现在大多沿袭AD的造模过程。防治认知功能障碍的专家组［1?4］已达成共识，认为血管性病变是MCI发病的非常重要的原因。因此本实验的造模方法是在参照周振华等［5］的重度颈动脉狭窄动物模型制作方法的基础上通过结扎大鼠双侧颈动脉制备了MCI大鼠模型,并用Morris水迷宫测试法对Wistar大鼠造模前后学习记忆能力的改变进行评价。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  由中国医科大学动物部提供的合格Wistar雄性大鼠48只(体重200～250 g),随机分为MCI模型组、针刺百会组、针刺非经穴组、正常组每组12只。动物用标准食水饲养，自由摄取。

　　1.2  仪器与药品  自制鼠台、手术刀、手术剪、弯勾、眼科镊子、脱脂棉、持针器、缝合针、缝合线、注射器、“30号1寸华佗牌”毫针、 Hans电针仪、MT?200 morris水迷宫跟踪分析系统(S1000)。10%水合氯醛、75%乙醇、碘伏、注射用青霉素。

　　1.3  造模方法 大鼠于术前8～12 h禁食，期间可自由饮水，用10%水合氯醛(3 mL/kg体重,腹腔注射)将其麻醉后，仰卧位固定于手术台上，随后将颈部皮肤剪毛备皮并用活力碘消毒，行颈侧向切口，仔细分离皮肤和肌肉，显露并游离双侧颈总动脉，在颈总动脉近心侧距颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)分叉处约1.5 cm处用0号手术缝合线将颈总动脉和直径0.45 mm的注射器针头一并仔细扎紧丝线打成活结，然后小心拔出针头，缝合伤口，造成脑持续性低灌注。术后每日肌注青霉素1.6万u,连续 3d，抗感染。

　　1.4  针刺  选取百会穴(顶骨正中)、大鼠头部两侧固定的非穴位点(百会穴与耳根联线的中点)。方法：两穴均向前沿皮刺入5 mm,不进行手法刺激，连接Hans电针仪，施以连续波，频率20 Hz，电压2～4 V，强度以大鼠安静耐受为度(约为2 mA)，留针20 min，隔日1次，4周为1个疗程。

　　1.5  大鼠Morris水迷宫实验  在造模前后及针刺前后分别进行水迷宫实验，参照Morris［6］方法进行。

　　1.5.1  水迷宫的组成  水迷宫由圆形水池、平台、摄像头及电脑组成。水池直径120 cm，高50 cm，池内水深30 cm，圆形水面被通过圆心的两条假想垂线划分为4个象限，将直径10 cm、高28 cm的平台置于任意一个象限中央。

　　1.5.2  行为检测过程  实验前将牛奶与水混合,用加热器将水温加热至22～26℃。将大鼠绑一红布，以便摄像头追踪其运动轨迹。将大鼠从一固定位置放入池内，时间设为70 s，用摄像头跟踪其运动轨迹，用电脑记录其运动轨迹。如经70 s未找到平台者，将其引领至平台，放置30 s后，再次从固定位置放入池内重新设定记录其运动轨迹。第1、2、3 d为训练期,不记录成绩。

　　1.5.3  定位航行实验(place  navigation)  定位航行实验用来检测大鼠获取经验(学习)的能力。造模前后及针刺治疗后各组大鼠均接受此实验检测。方法：每次实验大鼠将从同一个固定位置放入水池，其入水后尽力逃避水患，当发现平台后则栖身其上，每次的训练时间设定为70 s，作为最大潜伏期，即逃避到平台上的潜伏期(escaping latency)。如果小鼠在70 s内未找到平台，其潜伏期按70 s，记录各大鼠寻找平台的时间。时间越短表明大鼠的学习记忆能力越好。

　　2  结果

　　2.1  一般情况  结扎双侧颈总动脉后，大多数大鼠眼睑下垂，活动能力低下，自发运动减少。MCI模型组死亡2只(1只麻醉过量，1只在造模时分离颈动脉过程中死亡)，针刺非经穴组死亡1只(造模后因呼吸困难死亡)。死亡大鼠实验数据不做统计。

　　2.2  对大鼠学习记忆的影响  见表1。
   
　　表1  各组大鼠逃避潜伏期比较（略）

　　注：与本组造模前潜伏期比较，#P<0.05；与正常对照组造模后、后潜伏期比较，△P<0.05
   
　　由表1显示，造模前，各组大鼠逃避潜伏期无显著性差异(P>0.05),说明各组大鼠逃避潜伏期基本一致，即大鼠学习的能力基本一致；造模后,MCI模型组、针刺百会组及针刺非经穴组大鼠潜伏期与正常对照组比较，其潜伏期明显延长,呈显著性差异(P<0.05)，提示结扎双侧颈动脉对大鼠学习的能力造成了影响；治疗后，正常对照组大鼠的逃避潜伏期短于MCI模型组和针刺非经穴组，呈显著性差异，针刺百会组与MCI模型组比较差异显著(P＜0.05)。针刺百会组能使MCI模型大鼠潜伏期明显缩短。

　　3  讨论
   
　　AD的发病率逐年上升,严重威胁人类的健康，因此对痴呆前期——MCI期的治疗有更重要的价值和意义。MCI的基础研究离不开动物模型，本实验通过结扎大鼠双侧颈总动脉制备了MCI大鼠模型，且本方法有利于机体缓慢达到脑供血不足的状态,与临床慢性脑缺血接近。Rao［7］对1977～1997进行的颈动脉狭窄与认知功能障碍关系的14项研究进行了汇总分析:其中12项发现颈动脉狭窄组患者有认知功能障碍。颈动脉狭窄后可能发生一系列的病理生理改变，导致持续低灌注，而细胞正常功能的维持需要充分的能量供应，认知功能减退可能是慢性缺血，或持续低灌注造成的能量供应减少的后果。
   
　　电针治疗通过激发腧穴特性与人体生物电的耦合作用，可促进脑部循环，改善组织供血供氧，提高脑功能，改善智力状况［8］。本实验可观察到:针刺治疗后,与MCI模型组比较,针刺百会组能显著缩短定位航行试验的潜伏期(P<0.05)。由此可以看出针灸对于早期干预MCI，延迟或阻止痴呆的发生、有很重要的临床意义。针灸治疗MCI是通过多种途径来进行的，具有重要的学术价值、推广意义及应用前景，它确能提高临床疗效，又具有无毒副反应的优势，因而具有较大的潜力。因此，今后需进一步加强针灸防治本病的临床与机理研究，以适应已经到来的老龄化社会的需要。
   
　　本实验的大鼠模型具备了MCI的患病因素(即脑低灌注),且呈现了较为明显的学习、记忆能力减退特征，与临床MCI患者病理过程较为接近，此模型的建立可以研究和识别MCI，将有助于发现具有最佳干预时机的个体，为临床痴呆的防治提供一个最佳防治时间窗，为进一步的预防性药物干预研究奠定基础。

【】
  　［1］Petersen RC,Doody R,Kurz A,et al.Current concepts in mild cognitive impairment［J］.Arch Neural,2001(58):1985?1992.

　　［2］陈晓红,王荫华.轻度认知功能障碍：AD的极早期阶段［J］.中华神经科杂志,2002,35(6):374?376.

　　［3］贾建平.重视轻度认知障碍与老年痴呆关系的研究［J］.中华神经科杂志,2002,35(6):324?326.

　　［4］防治认知功能障碍专家共识专家组.中国防治认知功能障碍专家共识［J］.中华内科杂志.2006,45(2):171.

　　［5］周振华,等.可控制狭窄程度的鼠颈动脉狭窄模型建立及认知功能改变［J］.中国临床康复,2005,8(28):6052.

　　［6］Morris R G M,Garrud P,Raulins J NP,et al.Place natigation impaired in rats with hippocampal lesions［J］.Nature,1982(29):681.

　　［7］Rao R.The role of carolicl slcnosis in vascular cognitive impairment Eur Neurol,2001(46):63?69.

　　［8］刘 军,彭晓虹,林大东,等.电针头穴治疗血管性痴呆临床研究［J］.中国针灸,1998,18(4):197.