排脓散活性成分对小鼠的抗炎作用及其配伍的定量研究

                       作者：陈君超, 李禄金, 文世梅, 何迎春, 刘红霞, 郑青山

【摘要】  目的：观察排脓散各药味部分活性成分的抗炎作用，并对其不同配伍进行定量研究。方法：选择排脓散中的部分活性组分芍药苷、柚皮苷加新陈皮苷、桔梗皂苷，用正交设计法安排实验，剂量两水平分别为用药和不用药。选择醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进为急性炎症模型，以阿司匹林和生理盐水为对照，以对毛细血管通透性影响作为炎症指标，定量分析各药味活性成分的抗炎作用及相互作用。结果：全方活性成分组合（柚皮苷加新陈皮苷、芍药苷、桔梗皂苷）对醋酸所致炎症渗出的抑制效果与阿司匹林组比较，差异无统计学意义（P>0.05），药效模拟结果提示为最大效应组合。与生理盐水组比较，排脓散中各药味活性成分及其他不同配伍组合均不同程度抑制炎症的渗出（P<0.01）。复方配伍的预测效应区间为0.115～0.170（光密度值），全部活性成分组合呈现协同作用；各活性成分对复方的贡献按重要程度排列为：芍药苷>柚皮苷加新陈皮苷>桔梗皂苷。 结论：排脓散各药味活性成分对抑制小鼠腹腔毛细血管通透性均呈正性作用，芍药苷贡献度最大，全方活性成分组合抑制作用最强。采用正交模拟法对复方配伍进行定量分析，有可能挖掘出更多的复方配伍信息。

【关键词】  排脓散; 活性成分; 中药配伍; 药物相互作用.

    Methods: The mouse model of acute inflammation with increase of capillary permeability was induced by intraperitoneal injection of acetic acid. An orthogonal design with 2 levels (used and unused) was applied to assign the combinations groups of active ingredients including naringin and neohesperidin, peoniflorin, and platycodin. Aspirin and normal saline were administered as control. The pharmacodynamic interactions were analyzed by the optical density (OD) of infiltrated Evans blue.

    Results: The different combinations of active ingredients showed anti?inflammatory effect with different degree, and the predicted values of OD varied from 0.115 to 0.170. The maximum anti?inflammatory effect was from the combination of naringin, neohesperidin, paeoniflorin and platycodin, better than that of the saline group (P<0.01). However, there was no significant difference as compared with the aspirin group (P>0.05). Paeoniflorin showed a dominant contribution to the formula, and platycodin the least. The combination of all active components exhibited synergism.

    Conclusion: The results suggest that all the ingredients are efficacious constituents of the formula, and paeoniflorin shows a dominant contribution to the formula. More information about prescription compatibility can be obtained by the orthogonal simulation method.

    Keywords: Painong powder; active ingredient; compatibility (traditional Chinese drug); drug interactions

    排脓散始载于《金匮要略》，由枳实（Fructus Aurantii Immaturus）、芍药（Radix Paeoniae Alba）和桔梗（Radix Platycodi）组成，具有止痛、排脓的功效。方中各药味配伍比例为3︰3︰1，临床上主要用于炎症的急性期［1］。我们前期研究表明，其复方煎剂不仅对醋酸所致小鼠毛细血管通透性增加具有抑制作用，并且各药味之间具有协同作用［2］。有研究报道芍药和桔梗中抗炎作用的主要活性成分分别为芍药苷（paeoniflorin）和桔梗皂苷（platycodin）［3?6］，枳实的抗炎活性成分为柚皮苷（naringin）和新陈皮苷（neohesperidin）［7］。本研究以各药味活性成分来替代中药，继续选择醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进为急性炎症模型来观察组分配伍的抗炎作用。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  健康昆明小鼠，体质量（20±2）g，清洁级，雌雄不限，由上海市斯莱克动物有限公司提供，合格证号为SCXK?(沪)2003?0003。

    1.1.2  药品与试剂  芍药苷（纯度92.1%）、桔梗皂苷（纯度80.2%）、柚皮苷（纯度95.8%）、新陈皮苷（纯度93.7%），分别从中药白芍、桔梗和枳实中提取［8?10］，药材饮片均购于上海康桥药业有限公司；阿司匹林肠溶片（25 mg/片），购自上药集团信谊制药总厂。伊文思蓝（批号为WC20070207）、纯冰醋酸（批号为T20070612）和生理盐水（批号为H31021918），均由上海国药集团化学试剂有限公司提供。

    1.1.3  主要仪器  721型分光光度计，购自上海光谱仪器有限公司；TGL?16G型离心机，购自上海安亭仪器厂。

    1.2  实验方法

    1.2.1  实验设计  各药味活性成分根据剂量设置为两水平（用药和不用药），其中A为芍药苷、B为柚皮苷+新陈皮苷、C为桔梗皂苷（见表1）。各组分剂量大小的设置分别相当于从相应中药材中提取的量（枳实30 g、白芍30 g、桔梗10 g）。见表1。各组分根据正交设计分为7组，另加阳性药（阿司匹林）对照组和阴性（生理盐水）对照组，每组10只昆明小鼠，共90只。表1  各药味活性成分剂量设置水平

    1.2.2  实验方法  急性炎症模型制作方法参照［11］。各组小鼠分别灌服相应配伍组合的活性成分混合液，阿司匹林组小鼠灌胃量为0.25 g/kg。当天单次给药1 h后，尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液0.01 mL/kg，随后立即腹腔注射0.6%醋酸0.20 mL/只。20 min后脱颈椎处死，剪开腹部皮肤肌肉，用6 mL生理盐水分数次洗涤腹腔，吸管吸出洗涤液，合并加入生理盐水至10 mL，3 000 r/min（离心半径3 cm）离心15 min，取上清液于590 nm比色测定光密度（OD）值。

    1.3  定量分析方法  t检验、正交设计方差分析、药效预测及其预测误差（predicted error, PE）均由DAS 2.1.1软件完成，其具体详细的公式和方法文献［12］。不同组合相互作用性质不同，由此引起的交互效应（drug interaction, Eint）也不同。相互作用指数用Q来表示，Q>0为协同，Q<0为拮抗，Q=0为相加。药效预测误差由散点图来表示，横坐标（PE1）表示模拟拟合度，PE1=（实测值－预测值）/实测值；纵坐标（PE2）表示数据离散度，PE2=（实测值－组均值）/实测值。若大于70%的散点分布于评价窗（Evaluation Window）30%的预测偏倚内，表示模型的模拟能力可靠（reliability），即模型可以准确有效地对各配伍组药效进行预测。

    2  结  果

    2.1  对毛细血管通透性的影响  各组实验结果见表2，阴性对照组提供了药效基线值（baseline of response, Ebase），即第8组的平均药效。各组分配伍组对小鼠腹腔毛细血管通透性均显示不同程度的抑制作用，其OD值与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。组分配伍1、2、3组与阿司匹林组比较，差异无统计学意义（P>0.05），其他各组均劣于阿司匹林组（P<0.05）。表2  各配伍组对毛细血管通透性的影响

    2.2  药效学参数分析  药效学参数分析结果根据正交模拟法［12］获得，其参数列于表3。各组分对复方药效的贡献值大小排序为A>B>C，也是重要程度排序。结果显示芍药苷对复方的贡献值最大，发挥主要药效。

    组分有效性判别见表4，不同无作用区间（no effect boundary, NEB）对双向单侧t检验结果影响很大，NEB越窄，90%可信区间（confidence interval, CI）越易超出。本研究NEB预设为90%～110%。双向单侧t检验显示各组分均为药效组分，发挥正性作用。

    2.3  组分相互作用分析  不同组合相互作用性质不同，相互作用分析显示全方配伍协同作用明显，相互作用指数Q值达6.4，而其他两两组合相互作用均为拮抗。见表5。

    2.4  复方效应模拟及评价  本复方的最大效应（maximum effect, Emax）组合为ABC（即全方组合），最小效应（minimum effect, Emin）组合为C，OD值效应区间为0.115～0.170。由正交模拟法对不同组合的药效进行预测（表6），各配伍组PE均小于15%。用实验数据对预测模型进行验证，结果由散点图表示除空白组外70只小鼠药效模拟值与各配伍组实测药效均数间关系（图1A），其中76%（53/70）的散点分布于30%评价窗内，显示模型模拟结果具有可靠性（reliability）。进而利用门特卡罗模拟（Monte Carlo simulation）扩大样本量至700（图1B），81%的散点分布于评价窗内，提示了模型的稳定性（stability）。以上结果表明模型能够有效模拟各配伍组合效应。表3  复方药效学模型参数表4  双向单侧t检验表5  配伍组交互效应和组分相互作用性质表6  不同组合的药效模拟OD值

    3  讨  论

    在对复方组成药物活性成分有所了解的情况下，利用药味活性成分进行组方配伍成为新近复方研究的特点。基于醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的模型研究，我们发现无论复方煎剂［2］还是各药味活性成分实验各配伍组药效OD值基本一致。排脓散各药味活性成分配伍按重要程度排列为芍药苷(A)、柚皮苷+新陈皮苷(B)、桔梗总皂苷(C)。芍药苷的药效最强，这也和中药药理研究［13］芍药苷的抗炎作用相符。

    各配伍组药效模拟拟合度较好，显示最大效应组合为全方所有活性成分配伍；相互作用分析显示只有全方配伍时才表现为明显的协同作用，以上结果与前期复方煎剂研究一致［2］。虽日本学者报道［7］排脓散抗炎作用的活性成分为柚皮苷、新陈皮苷和芍药苷，未提及桔梗总皂苷，但本研究证实了桔梗皂苷同样在复方中发挥药效，并认为可能是日本学者对排脓散的提取工艺导致未测到桔梗皂苷。

    中药复方配伍研究需综合多指标，多水平进行深入研究。若选择关键指标，重点突破，也是一种方法。文中采用正交模拟法［12, 14］对配伍进行定量分析，不仅可获得每一组分在复方中的药效强度，判断其重要性，并能分析不同配伍组合之间的相互作用，且能有效模拟各配伍组合的预期药效，为中药复方的拆方研究提供指导和意义，为中药新药的二次开发提出新思路。基于此，本文通过排脓散的研究，希望为同类研究提供方法上的借鉴。

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