三种治法体外抗流感病毒的实验研究

                          作者：周坤福，刘琳琳，陆平成

【关键词】  清热解毒法

    清热解毒法是临床流感病毒性肺炎常用方法，宣肺化痰也是治疗该病的一个重要治法，近年来应用养阴清肺法在临床辨证治疗流感病毒性肺炎也有一定疗效。本研究试图从中医外感理论出发，由流感病毒入手，通过实验来观察上述三种治法抗流感病毒的作用，探讨其机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  药物  清热解毒治法用方采用金银花、连翘各12 g，贯众、蚤休各15 g，香薷10 g；宣肺化痰治法采用麻杏石甘汤原方：麻黄、杏仁各9 g，生石膏18 g，甘草6 g；养阴清肺治法用方采用生地、玉竹各15 g，金银花12 g，鱼腥草20 g，黄芩10 g。各生药由南京中医药大学附属中门诊提供。按常规制成100％水煎液，注射鸡胚所用药液均以1500 rpm低速离心5 min，取上清液置高压锅中灭菌30 min，置4 ℃冰箱内放置备用。利巴韦林：100 mg/片，华北制药集团制药业有限公司，批号：040646。

    1.1.2  鸡胚  10日龄SPF鸡胚，购于南京生物药厂养殖中心。

    1.1.3  病毒  流感病毒FM1株由南京中医药大学微生物教研室提供。

    1.1.4  实验设备  隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂产品，型号：PYX-DHS-50×65；净化工作台，吴江市净化设备厂产品，型号:YJ-875SDB；电热手提压力蒸气消毒器，上海医用核子仪器厂产品，型号：YXQ·SG4·280。

    1.2  方法

    1.2.1  病毒制备  将病毒液和生理盐水1∶20稀释注射鸡胚后置37 ℃温箱，48 h后放4 ℃冰箱过夜，取鸡胚尿囊液进行血凝实验。大孔塑料板内用生理盐水将尿囊液先按1∶10稀释，再进行倍比稀释1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280，1∶2560，1∶5120，共得10个浓度梯度。每孔加入0.5%的鸡红细胞悬液，摇匀，静置45 min后观察。根据血细胞凝集程度的不同来进行判断，以（++）为终点，即观察到红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块，以此为标准测定血凝滴度［1］。取血凝滴度在1∶640以上的尿囊液混合并分装无菌试管，低温冰箱保存备用，作为实验用病毒液。

    1.2.2  鸡胚半数感染量的测定  取出病毒1支，快速融化后置冰水杯中，用生理盐水按10倍稀释至10管。40只鸡胚，随机分为10组，每管接种4个胚。培养48 h后，取尿囊液加等量0.5%鸡红细胞悬液做血凝实验，出现血凝者为阳性。用Reed-Muench法［1］鸡胚半数感染量EID50为10～8.67。

    1.2.3  中药对鸡胚毒性作用测定  将中药和利巴韦林分别以灭菌生理盐水连续做2倍稀释，各3个浓度，分别接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.2 ml，每个浓度接种5胚，37 ℃孵育，连续观察鸡胚生长发育情况。以鸡胚可存活96 h的最大浓度作为药物的最大无毒剂量。测定结果：最大无毒剂量清热解毒方为6.24 g/kg，宣肺化痰方为16.38 g/kg，养阴清肺方为7.02 g/kg，利巴韦林为0.07 g/kg。

    1.2.4  分组、造模及给药  取60只鸡胚随机分为6组：正常组、模型组、阳性组、清热解毒组、养阴清肺组和宣肺化痰组。模型组与阳性组用病毒接种后，分别再以生理盐水与利巴韦林注射。三种治法方药组各采用三种方法，（1）对病毒的直接杀灭作用：将稀释好的药液与病毒等量混均后接种鸡胚；（2）对病毒的预防作用：鸡胚先注射中药，37 ℃温箱1 h再接种流感病毒；（3）对病毒的作用：鸡胚先接种流感病毒液，37 ℃温箱1 h再注射中药。病毒剂量均为100EID50的流感病毒0.1 ml。

    1.2.5  指标测定  将各组鸡胚置37 ℃温箱48 h，每日观察1次，死亡者弃去。48 h后取出置4 ℃冰箱过夜，收集尿囊液做血凝测定，观察并记录结果。

    1.3  统计学方法  数据均采用均数±标准差（x±s）表示，应用t检验进行比较。

    2  结果

    2.1  三种治法对流感病毒的直接杀灭、治疗与预防作用  见表1。表1  三种治法对流感病毒的直接杀灭、治疗与预防作用（略）注：与模型组比较，*P<0.01，△P>0.05

    2.2  实验结果  清热解毒、宣肺化痰、养阴清肺三种治法体外均有抗病毒作用。清热解毒、养阴清肺法对流感病毒有直接杀灭作用，三种治法对流感病毒感染鸡胚的治疗与预防都有效果。

    3  讨论

    清热解毒法是临床治疗流感病毒性肺炎常用方法。黄星垣［2］认为，温病病机以论毒为始，即毒随邪入，热由毒生，变由毒起，毒不去则热不除，变必生；由卫而气而营而血，治热治变均以解毒清热贯穿始终。临床用于治疗属于中医热毒证的诸多感染性疾病效果满意，研究证实抗感染的大部分方药均为清热解毒类药物。肺失宣降、痰热内蕴是该类疾病的基本病机之一。因此，宣肺化痰也是治疗该病的一个重要治法，其代表方首推痳杏石甘汤。结合病毒性肺炎病理改变和病理生理机制，中医治疗病毒性肺炎在清热解毒的同时，兼以扶正。近年来应用养阴清肺法在临床辨证治疗流感病毒性肺炎也有一定疗效。本研究从中医外感理论出发，由流感病毒入手，通过体外抗病毒实验来观察上述三种治法抗流感病毒的作用。有些病毒和病毒的血凝素能引起人和一些哺乳类动物的红细胞发生凝集，这就是红细胞凝集现象。流感病毒能与人、鸡和豚鼠等动物的红细胞发生凝集，其原理是流感病毒能作用于红细胞表面的糖蛋白受体，病毒被吸附到红细胞上而产生凝集。该现象可以作为病毒鉴定的一个指标。上述实验结果表明，三种治法在鸡胚体外对流感病毒有抑制作用，清热解毒法和养阴清肺法均有直接杀灭病毒的作用，降低病毒的感染力，宣肺化痰法则无此作用；三种治法对流感病毒都具有治疗与预防作用，提示能抑制流感病毒的增殖，对鸡胚具有保护作用使其免受病毒侵害。

【】
  1 医学院流行病防治研究所.常见病毒病实验技术.北京：北京科学技术出版社，1979，1.

2 黄星垣.中医内科急症治疗研究与探讨.云南中医杂志，1991，2（2）:19.