正常与不同证候 H22 荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因
作者：潘志强 方肇勤 卢文丽 梁超 吴中华 刘小美 侯俐 张辉 卓少元 廖明娟 高必峰
【摘要】 目的：揭示正常与不同证候昆明种荷瘤小鼠肾上腺高表达的基因。方法：采用昆明种正常小鼠与腋下接种 H22腹水瘤细胞的小鼠，取接种肿瘤后第 8 天（早期）邪毒壅盛证与气虚证、第 21 天（中期）阳气虚证、第 29 天（中晚期）气阴阳虚证荷瘤小鼠与正常对照组小鼠肾上腺，抽提 RNA、纯化及 Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array 检测。结果：筛选到402 条高表达的基因，其中有 1 个及以上组别芯片读数值大于 5 000 的有 88 条。这些基因主要参与代谢和基因表达的调控，部分参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导，以及部分参与免疫、细胞周期和细胞凋亡、发育；另有许多基因功能未知。结论：这些在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达的基因，可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意义；鉴于气虚证荷瘤小鼠这些基因大多表达量低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠，反映出气虚证候的本质及特征；再次，4 个不同证候荷瘤小鼠肾上腺这些基因表达差异分别有集中的趋势，印证了中医学“同病异证”的理论及其本质，要求辨证论治。
【关键词】 肾上腺；小鼠；基因表达；基因芯片；肿瘤
〔Abstract〕 Objective To reveal the character of high expression genes in adrenal gland of normal and H22 tumour mice about typical symptoms and signs. Methods By the quantitative four diagnosis and syndrome differentiation methods and GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array, we observed adrenal gland gene expression about poisonous pathogenic factors syndrome and asthenia of qi syndrome on 8th day, asthenia of yang and qi syndrome on 21th day, asthenia of qi and yin and yang syndrome on 29th day with H22 tumour mice. Results 402 high expression genes were gained, and the computed value of 88 genes are more than 5 000. These genes participate in metabolism, gene expression and regulation, chemistry synthesis and processing and modify, transport, signal transduction, immunization, cell cycle, apoptosis, development,and some genes function are unknown. Conclusion Those genes are persistent and steady expression in normal and H22 tumour mice adrenal that could be important biology significance. Genes expressed down-regulate may be reflect the essence and feature of asthenia of qi syndrome. Otherwise, differentially expressed genes in adrenal gland have coherent tendency among four different symptoms and signs, which confirm the theory and essence about different symptoms and signs of the same disease, and it is essential to execute syndrome differentiation and treatment.
〔Key Words〕 Adrenal gland; Mouse; Gene expression; GeneChip; Tumour
肾上腺是机体的重要内分泌组织，在维持内环境稳定、应激、机体防御、免疫调控及糖、脂肪、水与电解质代谢中发挥重要作用，并受下丘脑-垂体的精密调控。以往对肾上腺的研究主要集中在以下几方面[1，2]：①肾上腺皮质和髓质的功能；②肾上腺激素的合成、分泌与代谢；③肾上腺激素合成的酶，如 20，22-羟化酶，20，22-碳链裂解酶、3β- 羟类固醇脱氢酶、21-羟化酶、17-羟化酶、11-羟化酶等；④酶的有关调节因子[3]，如白细胞介素类；胰岛素样生长因子；转化生长因子；碱性成纤维生长因子；肿瘤坏死因子α；集落刺激因子；干扰素等，所涉及的基因不多。最近，我们在 H22 荷瘤小鼠证候本质的研究中，采用 Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array 检测了正常与不同证候荷瘤小鼠肾上腺基因的表达差异，观察到许多高表达的基因，推测这些基因在维持肾上腺功能方面具有重要的作用，而且可能与证候本质有关，鉴于这些基因以往大多在肾上腺的研究中涉及不多，特报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 昆明种雄性小鼠 250 只，体重（25±1）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号 SCXK（沪）：2003-0003。
1.1.2 试剂 主要试剂有：Trizol（GIBCO BRC）、RNeasy Mini Kit（QIAGEN），RNA Nano LabChip 及 Gene Chip Mouse Exon 1.0 ST Array 及其试剂盒（2006 年）。
1.1.3 芯片检测仪器 小鼠四诊工作站、标准化四诊检测与辨证方法参见有关[4]；Agilent-bioanalizer 2100，以及 Affymetrix 的芯片杂交炉、芯片洗涤系统、芯片扫描仪等。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及处理 随机取 60 只小鼠作正常对照，另 190 只腋下接种 H22 肿瘤腹水癌细胞 0.2 mL（4×107个/mL），出瘤后淘汰 40 只出瘤不佳及畸形小鼠，余 150 只。取正常小鼠 20 只，及荷瘤小鼠 150 只，共计 170 只用于四诊计量检测和辨证，另 40 只正常对照小鼠不做四诊检测，常规饲养。
1.2.2 四诊计量化检测方法与计量辨证方法 参见有关文献[4]。
1.2.3 荷瘤小鼠分期与常见证候的确定 依据我们以往的研究，分别于接种肿瘤后第 7 天（早期）、第 20 天（中期）、第 28 天（中晚期）进行全体小鼠四诊检测与辨证，并分别于检测后的次日，即接种肿瘤后第 8 天（早期），辨证并筛选出最为典型的邪毒壅盛、气虚证候小鼠各 16 只，第 21 天（中期），辨证并筛选出最为典型的阳气虚证候小鼠 16 只，第 29 天（中晚期），辨证并筛选出最为典型的气阴阳虚证候小鼠 16 只。
1.2.4 不同证候荷瘤小鼠的处死与取材 分批、分别处死以上各证候和正常对照小鼠，取下丘脑、垂体、甲状腺、肾上腺、睾丸、胸腺、脾脏和肿瘤组织。
1.2.5 组织 RNA 的提取与检测 以上共 5 组样本采用 Trizol 和 RNeasy Mini Kit 及其方法分离和纯化 RNA；采用 RNA Nano LabChip 和方法检测 RNA 的质量。
1.2.6 芯片检测 采用 Affymetrix 的 GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array 及其试剂盒所建议的检测方法。依据检测结果和 Affymetrix 建议的方法，采用 iterPlier 法计算核心基因表达读数值。
以上 RNA 质量和芯片检测委托上海生物芯片有限公司完成。
1.2.7 各组小鼠肾上腺高表达基因的筛选 筛选出各组小鼠肾上腺芯片读数计算值均大于 3 000 的，4 个不同证候荷瘤小鼠组与正常组比值一致介于0.5~2 倍之间基因。
1.2.8 基因功能的检索方法 文中的基因功能主要文献[5]，及其 NCBI 数据库中的 PubMed、OMIM、OMIA 等进行检索。
2 结 果
在 16 661 个核心基因中，符合以上筛选条件的基因有 402 条，其中有 1 个及以上组别芯片读数计算值大于 5 000 的有 88 条。其特征为，正常和不同阶段荷瘤小鼠肾上腺表达量均很高，不同组别间的差异小，说明这类基因在正常与疾病小鼠肾上腺内持续且稳定表达，可能对于维持肾上腺的正常生理功能具有重要的生物学意义。具体如下。
2.1 肿瘤发生后不同证候具有下调趋势的基因
正常组比 H22 荷瘤小鼠各阶段表达高的基因较少，肿瘤发生后有不同程度的表达下降，其中，早期邪毒壅盛证的表达量略高于气虚证，提示其肾上腺的活跃程度强于后者。见表 1。
这类基因主要参与化学合成和代谢过程。 Cyp11a1 属于细胞色素 P450 亚家族类，主要参与 C21 类固醇激素生物合成，类固醇和脂代谢，传递等过程，其中在类固醇激素生物合成第一步由胆固醇合成为孕烯醇酮过程中起关键作用，有研究表明人正常及病理皮肤也表达 Cyp11a1、 Cyp17、Cyp21a2 等[6]。Fth1为铁蛋白重肽 1，在肝脏、脾脏中主要参与铁离子运输和稳态，免疫应答，负调控细胞增殖等。有研究报道 c-myc 可以抑制 Fth1 表达[7]。Tsc22d1 为 TSC22 域家族成员 1，别名 Egr5，Tgfb1i4，发现在骨骼肌中有高表达，参与调控转录等。Dad1 为抗细胞死亡防卫因子 1，主要参与细胞凋亡，蛋白氨基酸 N 连接糖基化经天冬酰胺等过程。Fth1、Tsc22d1、Dad1 这 3 条基因在肾上腺组织的研究中未见报道，本研究各组小鼠肾上腺均为高表达，提示它们可能具有重要的生意义。
2.2 荷瘤小鼠早期不同证候肾上腺具有上调趋势的基因
肿瘤发生的早期，肾上腺原先一些高表达的基因，其表达量进一步增加，集中在邪毒壅盛证候荷瘤小鼠，同期的气虚证小鼠仅个别基因表达有增加趋势。这类基因大体可以分为以下几类：
2.2.1 参与代谢过程的基因 这类基因以邪毒壅盛证表达增加为主，见表 2。
其中，Aldoa 为醛缩酶 A，主要参与果糖代谢，糖酵解等，在各组小鼠中表达量非常高，肾上腺糖代谢活跃。Psap 基因主要参与脂和鞘糖脂代谢[8]。Acly 基因为 ATP 柠檬酸裂合酶，主要参与柠檬酸和 ATP 分解代谢，辅酶 A 代谢。Serinc1 为丝氨酸整合因子 1，主要参与磷脂酰丝氨酸和鞘脂代谢。Pdha1 名为丙酮酸脱氢酶α1，主要参与乙酰辅酶 A 代谢，糖酵解[9]。Psma2 为蛋白酶体亚基α型 2，主要参与泛素依赖蛋白分解代谢。Psmb4 为蛋白酶体亚基β型 4，主要参与泛素依赖蛋白分解代谢。Taldo1 为转酰酶 1，主要参与糖代谢。Soat1 为固醇酰基转移酶 1，主要参与脂代谢，类固醇代谢等。
2.2.2 参与调控转录，信号转导等的基因。主要见于邪毒壅盛证，气虚证总体上反而有下调趋势。
Rps14 基因名为核糖体蛋白 S14，有 5 个外显子，主要参与核糖体小亚基组装和维持，负调控转录等，有报道在仓鼠卵巢细胞中对 Rps14 基因有较深入研究[10]。Nr4a1 为核受体亚家族 4 组 A 成员 1，主要参与调控转录，信号转导等。Calr 为钙网蛋白，主要参与调控转录，调控细胞凋亡等。Prkar1a 基因名为蛋白激酶 cAMP 依赖调控 Iα，主要参与调控转录自 RNA 聚合酶Ⅱ启动子，蛋白氨基酸磷酸化，细胞内信号转导级联等。Sqstm1 为死骨片 1，主要参与调控 IκB 激酶/NFκB 级联，细胞凋亡，免疫应答，细胞内信号转导级联等。
2.2.3 参与化学合成、化学加工修饰及运输过程的基因 也主要见于邪毒壅盛证。
Atp 5b 和 Atp5g3 为 ATP 合成酶 H+ 转运线粒体肽类，主要参与产生前体代谢分子和能量，离子运输，ATP 合成偶联质子运输等。Abcb1b 为 ATP 结合家族亚家族 B 成员 1，主要参与运输，应答药物。Laptm4a 为溶酶体关联蛋白跨膜 4α，主要参与运输。Ndufb3 为 NADH 脱氢酶 1β复合体亚基 3，主要参与电子传递，NADH 辅酶 Q。
在气虚证具有上调趋势的基因中，Star 基因名为类固醇能急性调控因子，主要参与 C21 类固醇激素生物合成，将胆固醇由线粒体外膜向线粒体内膜的转运，此过程是类固醇激素合成的限速步骤[11]。Dbi 为苯甲二氮卓结合抑制剂，主要参与运输，它能够将胆固醇从胞浆直接转移至线粒体内膜，有研究表明 Dbi 能反馈调节胰腺分泌和餐后胆囊收缩素的释放[12]。
2.3 荷瘤小鼠中期阳气虚证肾上腺高表达的基因
中期荷瘤小鼠比其他各组表达高的基因也较少，这类基因的特点是晚期气阴阳虚证、早期邪毒壅盛证表达也较高。见表 5。
这类基因主要参与化学合成和代谢过程。如，Hsd3b2 为羟基δ5 类固醇脱氢酶 3β和类固醇δ异构酶 2，主要参与类固醇生物合成，雄激素和雌激素生物合成[13]。Adh1 为醇脱氢酶 1，主要参与醇代谢。Cox6c 为细胞色素 c 氧化酶亚基 Vic，主要参与传递。Atp5c1 为 ATP 合成酶 H+ 转运线粒体 F1 复合体γ肽 1，主要参与产生前体代谢分子和能量，离子运输，ATP 合成偶联质子运输等。
2.4 荷瘤小鼠中晚期气阴阳虚证肾上腺高表达的基因
荷瘤小鼠中晚期气阴阳虚证肾上腺比其他各组表达高的基因数量多，依据其参与的生物学过程，可以分为以下几类，见表 6 ~ 表 8。
2.4.1 参与代谢运输类基因 见表 6。
其中，Scarb1 基因名为清除因子受体类 B 成员 1，主要参与胆固醇代谢，运输，细胞凋亡等。Akr1b7 为醇醛酮还原酶家族 1 成员 B7，主要参与糖代谢。Apoe 为载脂蛋白 E，主要参与脂蛋白代谢，脂运输，引导细胞凋亡等，有研究表明 Apoe 在下丘脑-垂体-肾上腺轴上基因型效应可能与阿尔茨海默病病理改变有关[14]。Cpe 为羧肽酶 E，主要参与蛋白水解，代谢，神经肽信号转导途径。Cyp2e1 为细胞色素 P450 亚家族，主要参与电子传递，参与亚硝胺代谢，可能与恶性肿瘤有关[15]。Mdh1 为苹果酸脱氢酶 1，主要参与糖酵解，苹果酸代谢，三羧酸循环。Fdx1 为铁氧还蛋白 1，主要参与维生素和类固醇代谢，电子传递等。
2.4.2 参与化学合成、加工修饰类基因 见表 7。
其中，Fads2 为脂肪酸脱饱和酶 2， 主要参与脂肪酸生物合成，有研究表明 Fads2 在人肺、小脑、视网膜及视网膜色素上皮细胞系 ARPE-19 也有表达[16]。Cyp21a1 属于细胞色素 P450 亚家族，主要参与 C21 类固醇激素生物合成，电子传递过程。Th 为酪氨酸羟化酶，主要参与神经递质儿茶酚胺生物合成，芳香氨基酸家族代谢等过程，是儿茶酚胺类合成的限速酶，在肾上腺素能神经元生理上起关键作用[17]。Rps3 为核糖体蛋白 S3，主要参与蛋白生物合成等。
2.4.3 参与转录、调控类基因 见表 8。
Etv2 为 ets 变体基因 2，主要参与调控转录等。Gnb2l1 为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β肽 2 样 1，主要参与信号转导，蛋白激酶 C 激活。Chga 为嗜铬粒蛋白 A（甲状旁腺分泌蛋白 1），主要参与血压调控。Ppp2ca 为蛋白磷酸酶 2 催化亚基α，主要参与调控细胞周期，调控 Wnt 受体信号转导途径，负调控酪氨酸磷酸化等生物学过程，有研究报道 Ppp2ca 过度表达对心功能有损害[18]。
3 讨 论
本研究采用的基因芯片检测了小鼠肾上腺 16 661 个核心基因，其芯片读数值均数为 480。我们以往的研究发现芯片读数计算值在 100 以上，RT PCR 大多可以检出，具有一定的表达量，而大于 500 则可以方便检出，表达量较大；而且一些组织中那些具有重要生理功能的基因，如垂体的 POMC，则表达量非常大，提示表达量大的基因可能具有重要的生理功能。这是本文关注这些基因的主要依据。
按各组芯片读数计算值大于 500，并且荷瘤小鼠各证候组与正常对照组比值小于 0.5 或大于 2 的，表达具有差异基因有 64 条。其中有肿瘤发生后肾上腺下调的基因如 LOC675719（similar to H3 histone, family 3B）、Hbxip、Ints1、Plp1、Scd1，有早期气虚证和中期阳气虚证下调显著的基因如 Gh、Pomc1、Fasn，有中期阳气虚证独特上调的基因如Pip、Abpg、Klk1b26、Klk1b3、Klk1b4、Ctrc、Ctrb1，以及有中晚期阴阳气虚证上调的基因，如Cyp11b2、Ucp1、Alb1、S100a8 等，这些基因将另文介绍。
本文作者所报道的肾上腺高表达的基因 88 条，其中有 1 组或以上，芯片读数计算值大于 5 000，表达量非常大，当肿瘤发生后，不同证候荷瘤小鼠这些存在上调或下调的趋势，虽然不具备显著的组间差异，但推测仍具有重要的生理与病理意义。经检索，这些基因以往在肾上腺生理与病理的研究中很少涉及，因此，公布这些基因，以及这些基因在不同证候荷瘤小鼠的表达是十分必要的。
以往有关这些基因的研究发现，其生理功能主要参与代谢和基因表达调控，其次是参与化学合成、化学加工修饰、运输和信号转导类基因，再次是参与免疫、细胞周期和细胞凋亡、发育等过程，尚有一些基因功能未知。其中 Cyp11b2、Cyp11a1、Aldoa、Star、Dbi、Hsd3b2、Adh1、Cyp21a1、Apoe、Cyp2e1、Etfa 等在以往肾上腺类固醇激素的研究中已涉及，是维持肾上腺生理功能的重要已知基因，这些基因的高表达也印证了本芯片检测结果的可靠性。还有大量的高表达基因如 H3f3b、Scd1、Rps14、Scarb1、Akr1b7、Fads2 等，未见有关肾上腺的报道，这些基因在肾上腺中扮演的角色，以及相互之间的作用有待进一步研究。
有关肾上腺基因表达谱的研究，彭氏等[19，20]对人肾上腺基因表达谱曾有报道，发现表达丰度最高的基因是参与类固醇合成的酶类和蛋白。此外，神经肽类，如促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、黑色素浓集激素（MCH）、urocortin、可卡因、安非他明调节肽（CART）和垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）等激素、细胞因子及各类受体如 LDL 受体、HDL 结合蛋白和胆固醇合成酶等也有较高表达。显示肾上腺不仅是类固醇激素，也是许多其他激素及细胞因子合成的场所，并认为人肾上腺局部可能存在一个 CRH-ACTH-皮质醇调节。
我们发现，小鼠也有类似的表现。而且，通过荷瘤小鼠不同证候的同步比较，在中医证候的本质方面具有了更为重要的意义。首先，在这些高表达的基因中，大多气虚证荷瘤小鼠表达量低，低于正常小鼠和同期的邪毒壅盛证小鼠，这可能是气虚证候的本质及特征——肾上腺大量具有重要生理功能的基因表达量低；其次，虽同为荷瘤小鼠，接种肿瘤细胞数量一致，但同期的邪毒壅盛证荷瘤小鼠肾上腺一些基因的表达量大于同期的气虚小鼠，同一时间内肿瘤增长速率也快，充分印证了中医学“同病异证”的理论及其本质，要求辨证论治；再次，虽然邪毒壅盛证荷瘤小鼠肾上腺基因表达量大于同期的气虚小鼠，但预后差，提示其肾上腺部分基因表达活跃，带有调控紊乱的成分，并不利于该证候小鼠带瘤生存的时间。而中期和中晚期的阳气虚、气阴阳虚证候小鼠，在早期阶段，没有明显的邪毒壅盛和气虚证候，随着肿瘤的，肾上腺代偿功能逐渐增强，其基因表达的增加，可能与此有关；而且这还可能与这些小鼠遗传上可能使肾上腺具有较好的储备和代偿潜力有关。值得深入研究。
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