天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究
【摘要】 目的：探讨天然脑活素对人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）增殖能力和复制性衰老的影响及其机理。方 法： 光镜下观察 MRC-5 细胞衰老表型，常规计数细胞代龄、传代速度， MTT 法检测细胞增殖活度，X-Gal 染色法观察细胞衰老情况，计数衰老细胞百分率。 结果：天然脑活素可维持细胞的非衰老表型，增加 MRC-5 细胞代龄，天然脑活素 孵育 MRC-5 细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明显升高（P ＜ 0.05），细胞的增殖速度显著加快。另外，天然脑活素连续培养的细胞在老龄阶段衰老细胞数显著低于老龄对照细胞（P ＜ 0.01）。 结论：天然脑活素可升高 MRC-5 细胞增殖能力，有效延缓细胞的复制性衰老。
【关键词】 天然脑活素； 人胚肺成纤维细胞；增殖活度；复制性衰老；延缓
〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Natural Cerebrolysin on cell proliferation activity and replicative senescence of human embryonic lung diploid fibroblasts (MRC-5 cells) and its mechanism. Methods To observe the changes of senescent phenotype by light microscope, count the passage ages and velocity, detect the potential of cell proliferation by MTT. The changes of cells senescence of Natural Cerebrolysin-effected MRC-5 cells were studied by X-Gal staining method, and the positivecell rates of senescence cells were detected and analyzed.． Results Natural Cerebrolysin maintainedunaltered cell morphology and increased life span of MRC-5 by at least 18-21 passages. Comparing withthe control senium cells, the proliferation potential of MRC-5 cells incubated with Natural Cerebrolysin was increased obviously (P < 0.05), and the passage velocity was enhanced double of that of the controlsenium cells (P < 0.01). In addition, the positive cell rate of senescence cells was significantly lower in late passage cells in sequenced multigeneration culture in Natural Cerebrolysin than those of control senium cells (P < 0.01), and similar to those of young cells. Conclusion As a result, we concluded that Natural Cerebrolysin could notably promote the proliferation activity of MRC-5 cells and delay the cells replicative senescence efficiently.
〔Key Words〕 Natural Cerebrolysin; Human embryonic lung diploid fibroblasts; Proliferation activity; Delay; Replicative senescence
衰老（senescence）是细胞的重要生命现象之一，绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，当其经过一定的倍增之后，将进入终末增殖状态，称为细胞衰老。一般来讲，人类胚胎的成纤维细胞在达到衰老时，能够复制 50 代左右（Population Doublings, Pds），由于这种衰老是由分裂传代而达到的，故又称之为复制性衰老（replicative senescence）[1]。探讨细胞衰老的分子机理是人类认识自我研究的重要组成部分，从分子水平研究衰老过程中基因及调控变化，已成为目前衰老机理研究的主要方向，同时研究开发延缓衰老的药物将为提高人类生存质量提供重要保证，也为衰老相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。
天然脑活素为结合临床经验和药效学正交实验优化筛选而成，本研究在以往基础上以人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）为研究对象，观察了天然脑活素对 MRC-5 细胞表型、细胞代龄、传代速度、细胞生长增殖能力及衰老相关指标的影响，旨在探讨其延缓 MRC-5 细胞复制性衰老的作用及其机理。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株与动物 MRC-5 细胞是人胚肺成纤维细胞，由美国 ATCC 细胞库提供（ATCC No: CCL-171），并规定 28 代及以下为年轻细胞，50 代及以上为老年细胞，采用含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养液培养。
新西兰家兔，雄性，体重（1.5±0.2）kg，购自广东省医学实验动物中心，经 1 周的适应性饲养之后进行实验。
1.1.2 药品及试剂 研究用药天然脑活素由深圳市中西医结合临床研究所进行生药鉴定并由西安杨森制药厂制备成临床安全级粉剂，纯度为 98%。
胎牛血清、EMEM 培养基购自美国 Gibco 公司。MTT 购自 Sigma 公司。β- 半乳糖苷酶细胞化学染色试剂盒购自美国 KPL 公司。其他试剂均为国产分析纯级。
1.1.3 主要仪器 BIO-RAD 680 型酶联免疫检测仪（USA），Leica DM16000B 型图象分析系统（Germany），SANYO MCO-15AC 型二氧化碳培养箱（Japan）。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 共分 5 组，年轻对照组；空白老龄对照组；天然脑活素低剂量组；天然脑活素中剂量组；天然脑活素高剂量组，年轻对照组和空白老龄对照组以含 10% 正常空白血清的 EMEM 培养，天然脑活素低、中、高剂量组分别以含 2.5%、5%、10% 天然脑活素含药血清的 EMEM 培养液培养，血清含量不足 10% 的用正常空白血清补充。
1.2.2 实验含药血清的制备 含药血清的制备：将雄性新西兰家兔随机分为天然脑活素灌胃组、空白对照灌胃组，每组 6 只，根据成人量换算为家兔用量灌胃。每个家兔每天灌药量相当于上述配成的成药液 2~3 mL 。连续灌胃 1 个月，末次给药后 2 h 内后行颈动脉采血，离心分离血清，无菌过滤，56℃ 灭活补体，即为含药血清，10 mL分装后 -70℃保存备用。正常对照空白血清的制取是在灌胃相同体积的生理盐水及相同的时间后，用同样方式提取分离保存。
1.2.3 细胞培养 人胚肺二倍体成纤维细胞 MRC-5 采用加入双抗的含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养液培养，在饱和湿度、37℃ 、5% CO2 常规培养条件下培养，当细胞融合度约 90% 时，按照 1:3 或 1:4 传代。
1.2.4 细胞计数和细胞形态学检查 从第 30 代起，天然脑活素低、中、高剂量组、及空白老龄对照组细胞分别以含 2.5%、5%、10% 天然脑活素含药血清及 10% 正常空白血清 EMEM 培养液代替含 10% FBS 的 EMEM 培养液继续培养传代。光镜下跟踪观察细胞形态大小、胞浆折光性、浆内颗粒大小和密度以及细胞排列情况。
细胞总传代次数按 ∑log 2（ D/Do/R），D、Do 分别为收获和接种时的细胞密度，R 为细胞贴壁率； 细胞平均传代速度按公式（传代次数-28）/周数计算，细胞传代后如 3 周内不能融合，定义为细胞复制性衰老终末。
1.2.5 细胞增殖活度的检测——MTT 法测定 将第 52 代 MRC-5 细胞以每孔 1.0×104/mL 的密度接种于 96 孔板，200 L / 孔，常规培养 20 h，待细胞贴壁后，更换不同含药血清培养液 200 L / 孔，分别于培养 48 h 后，加 入 0.5% MTT 溶液 50 L，置 37℃ ，5 % CO2 条件下 4 h，出现蓝色结晶后，弃上清，PBS 洗 1~2 次，加入 DMSO 150 L / 孔，室温轻柔震摇 2~3 min 以充分溶解结晶，用酶标仪于 490 nm 测 A（OD） 值。
1.2.6 衰老细胞数的检测 将各组 MRC-5 细胞接种于盖玻片上，经干预处理后，PBS 洗 1 次，用 40 g/L 多聚醛固定细胞 45 min，用 X - 半乳糖苷酶（X-Gal）染液（含 20 mmol/L X-gal、40 mmol/L 醋酸-磷酸钠（pH 6.0）、5 mmol/L 铁氰化钾、5 mmol/L 亚铁氰化钾、150 mmol/L 氯化钠、2 mmol/L 氯化镁），37℃ 保温 4~8 h，然后用双蒸水冲洗 2 次，再固定 4 min（固定液：体积分数为 70% 乙醇、福尔马林、冰醋酸按 20:2:1 比例混合），流水轻轻冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。细胞胞浆染成青绿色的为衰老的阳性细胞，每张片子镜下计数 400 个细胞，确定 X-Gal 染色阳性衰老细胞数的百分比。
1.3 统计学处理
实验结果以数据和图表表示，测定值以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 8.0 软件包分析，两组比较采用 student t 检验，多组间均数比较用单因素方差分析，以 P < 0.0 5 为存在统计学显著性差异。
2 结 果
2.1 天然脑活素对细胞表型的影响
由图 1 可见，年轻组细胞呈梭性或长梭形，核仁清晰，胞浆折光性强，细胞融合速度快，细胞排列整齐有序；复制性衰老细胞形态变异，胞体扁平宽大不规则，核仁不明显，细胞排列凌乱无序，胞浆内颗粒累积，出现空泡，细胞融合速度减慢；天然脑活素处理组细胞老龄化程度不明显，细胞形态变化不大，而与年轻细胞相似。将已经出现衰老表型的老龄细胞转入含天然脑活素的 EMEM 中继续培养 24~72 h，细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但未见完全逆转。
2.2 天然脑活素对 MRC-5 细胞代龄和传代速度的影响
含天然脑活素血清的培养基连续培养 MRC-5 细胞，与用含同体积空白对照血清的培养基培养的 MRC-5 细胞进行对比，结果发现天然脑活素低、中、高剂量组细胞的代龄显著高于空白老龄对照组细胞。天然脑活素培养的细胞传代速度亦明显快于老龄对照细胞（见表 1）。
2.3 天然脑活素对细胞增殖活度（MTT 值）的影响
分别用空白对照血清和天然脑活素血清培养第 50 代 MRC-5 细胞 48 h 后，应用 MTT 法检测细胞的增殖能力。结果发现天然脑活素培养的细胞增殖活度明显高于空白老龄对照组细胞（P < 0.05），且随浓度增加而升高；与年轻细胞无显著性差异（P > 0.05） 。 提示，天然脑活素可促进 MRC-5 细胞的生长增殖（见表 2）。
2.4 天然脑活素对 MRC-5 细胞衰老细胞数目的影响
天然脑活素作用于衰老成纤维细胞一定时间，固定后用 X-gal 染色检测其 β- 半乳糖苷酶活性。 SA-β- 半乳糖苷酶染色阳性细胞的胞浆染为青绿色，空白老龄对照组细胞 SA-β- 半乳糖苷酶染色阳性细胞数远远高于年轻组细胞，而天然脑活素处理细胞组阳性细胞数较空白老龄对照组显著降低（P < 0.01），见表 2。提示，天然脑活素可下调 MRC-5 细胞 SA-β-半乳糖苷酶的表达，抑制细胞衰老，延长细胞寿命。
3 讨 论
绝大多数正常人类细胞在体外组织培养的序列传代过程中，逐渐丧失其增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增殖停滞状态，并可保持代谢活力的稳定，能够维持数月甚至数年。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名为衰老（senescence），而细胞达到衰老状态时的传代次数称为寿限[1，2]。衰老是由细胞所经历的传代次数决定的，而与时间无关。体外细胞的衰老与体内组织的衰老有直接的相关性[3，4]
人二倍体成纤维细胞（human diploid fibroblasts, HDFs）一般没有端粒酶活性，所以当端粒 DNA 长度丢失达到临界长度时，染色体变形急剧增加，染色体间发生融合， 细胞不再增殖，从而导致细胞衰老、死亡[5]，故常常被作为衰老研究的理想模型。衰老细胞除了不能复制传代之外，还表现出一系列生、形态学和多种分子生物学的改变，如形态大小不规则，胞浆内颗粒性物质累积，细胞排列散乱，培养基中多见细胞碎片，细胞失去融合能力、缝隙连接减少等[6-8]。
笔者以在体外只能进行有限次数分裂的人胚肺成纤维细胞（MRC-5）制备复制性衰老细胞模型，研究天然脑活素延缓衰老的作用及机理。实验发现，天然脑活素培养的细胞在老年阶段未见上述衰老表型，将已出现衰老样改变的细胞转入天然脑活素培养基中继续培养，细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但尚未见完全逆转，上述结果提示：天然脑活素能够维持 MRC-5 的非衰老表型。
细胞寿命常以体外培养时细胞传代次数表示。本研究结果显示，低剂量、中剂量、高剂量天然脑活素的 EMEM 培养的 MRC-5 细胞平均传代次数，显著高于老龄对照细胞；天然脑活素培养的 MRC-5 细胞传代速度也快于老龄对照细胞。提示天然脑活素可显著增加细胞寿命，其可能促进了细胞的增殖速度，这一结论被 MTT 实验进一步证实。
天然脑活素作用于正常衰老型成纤维细胞，通过测定衰老细胞的百分比，与老龄对照组细胞相比衰老细胞数目明显减少，衰老细胞百分比显著降低，提示天然脑活素可延缓衰老细胞的群体死亡的发生，从而延长细胞的体外寿命。
总之，本研究通过对细胞形态学、细胞寿命、细胞增殖活度、衰老细胞百分比等指标的研究，初步证实天然脑活素可通过促进细胞增殖速度，进而延缓 MRC-5 细胞的复制性衰老，为中药延缓衰老开辟了新的研究途径。关于天然脑活素对端粒酶活性、细胞端区缩短速率、基因损伤与修复能力以及衰老主导基因的表达的影响，本室正在进一步研究中。
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