兔骨髓间充质干细胞体外培养及生物学特性研究
【摘要】 目的：进一步研究兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）分离和培养方法及其生物学特性，为利用 MSCs 作为种子细胞多种疾病提供实验基础。方法：通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养兔 MSCs。测定其接种贴壁率，在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用甲基噻唑基四唑（methyl thiazdyl tetrazolium, MTT）法测 定 MSCs 生长曲线，并应用流式细胞术测定细胞表面标记物。结果：MSCs 接种 12 h 后贴壁率为 95% 以上，细胞倍增时间约为 30.8 h，平均传代时间约 5~7 d；培养的 MSCs 阳性表达 CD29、CD44、CD105，阴性表达 CD34。结论：在适宜的实验条件下，体外培养的 MSCs 能够稳定生存增殖并保持多向分化潜能，可作为组织工程的种子细胞。
【关键词】 骨髓间充质干细胞；生物学特性；细胞培养
The Biological Characteristics and Culture in Vitro of Rabbit Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells
〔Abstract〕 ObjectiveTo further study the isolation and cultivation procedures of mesenchymal stem cells from rabbit in vitro, and explore their biological properties. To build an experimental basis on applying MSCs as seed cells to treat many diseases. Methods MSCs were obtained from tibias by density gradient centrifugation and were tested the rate of adhesion. The configuration was observed under phase-contrast microscope consecutively and the cell growth was measured by MTT method. Cell cycle and surface antigens were detected through flow cytometer. Results The subcultured cells showed active proliferative ability. More than 95% of subceltured MSCs were adhesive in 12 h. MSCs were positive for CD29, CD44, CD105 and negative for CD34. Conclusion In present culture condion, MSCs showed stable and rapid growth in vitro . The characteristics make it possible to MSCs to be the seed cells for tissue engineering.
〔Key Words〕 Mesenchymal stem cells; Biological characteristics; Cell culture
干细胞是具有自我更新能力，且在适宜微环境下具有多系分化潜能的原始细胞[1]。近年研究发现，机体内除胚胎干细胞外还存在具有自我更新和分化能力的成体干细胞。其中骨髓中的干/粒细胞包括间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs），造血干细胞及网状内皮系统。 MSCs 可在体外扩增并有多向分化潜能[2-4]， 且取材方便，免疫耐受性、遗传背景稳定及易于转染外源基因等，因而作为组织工程“种子细胞”有“广泛的应用前景”[5-8]。本实验通过对兔 MSCs 体外培养法及其生物学特性进行研究，以建立一套稳定、成熟的兔 MSCs 培养方法，从而为细胞移植等组织工程提供种子细胞来源提供实验基础。
1 材料及方法
1.1 主要试剂与仪器
低糖 DMEM 培养基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（Hyclone 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 单克隆抗体和 FITC 标记的二抗（Lab vision）、MTT（沃宏公司）、倒置相差显微镜（OLYMPUS）、细胞培养箱（Forma）、流式细胞仪（FACSCalibur, BECTON DICKINSON 公司，美国）及超净工作台（ESCO）等。
1.2 实验动物
普通级健康新西兰大耳白兔，雌性，兔龄约 3 个月（南京市第一动物实验中心提供，许可证号：SCXK [苏] 2002-2007）。
1.3 方法
1.3.1 骨髓 MSCs 的分离纯化与培养 兔仰卧固定于兔台上，予 2% 利多卡因局麻后，持 16 号骨穿针，沿胫骨平台垂直刺入骨髓腔，外接肝素（3 000 U，0.2 mL）润洗过的 10 mL 无菌注射器，抽取骨髓 4 mL，缓慢叠于等量 Ficoll 淋巴细胞分离液（密度 1.077 g/mL）上，以 2 000 r/min 的速度离心 20 min，分离骨髓单个核细胞，收集界面上的细胞，移入另一离心管，PBS 洗涤，2 000 r/min 离心 5 min，反复 2 次，弃上清，悬浮于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基（青霉素 100 U/mL，链霉素 100 U/mL），轻轻吹打均匀，接种到 25 cm2 培养瓶，置 37℃，5% CO2 及饱和湿度培养箱中培养。4~6 d 首次换液，以后每 3 d 或 4 d 换液 1 次，14~21 d 细胞生长融合达 80% 以上，以 0.125% 胰蛋白酶消化，按 1:2 比例传代培养，倒置显微镜下逐日观察细胞形态。
1.3.2 骨髓 MSC 贴壁率检测 取对数生长期细胞，0.125% 胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，调整细胞浓度为 1×105/mL，接种于 24 孔培养板，每次孔 1 mL，每 2 h 取出培养板，吸去 4 孔培养液，0.1 mol/L PBS 漂洗除去未贴壁细胞，0.125% 胰蛋白酶消化后离心收集细胞，进行细胞计数，共观察 12 h，按以下公式逐个每个时相点的贴壁率：贴壁率=（贴壁细胞总数/接种细胞总数）×100%。
1.3.3 骨髓 MSCs 生长曲线的测定 取第 3 代生长良好的细胞，用 0.125% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM 制备细胞悬液，以每孔 103~104 个细胞于不同时相分别接种于 8 块 96 孔板中的 8 孔，每孔体积 200 L，置于 37℃、5% CO2 及饱和湿度培养箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 L，37℃ 继续孵育 4 h 后，每孔加入 150 L 二甲基亚砜，振荡 10 min 后选择 490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值 A（OD）为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.3.4 骨髓 MSCs 表面标记测定 取第 3 代MSCs，用 0.125% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 离心 5 min，PBS 洗涤 2 次，调节细胞浓度为 1×106/mL，分为 4 份，分别滴加人抗兔 CD29、CD34、CD44、CD105 一抗（以 PBS 代替一抗作为阴性对照），室温反应 30 min 后，PBS 洗涤 2 次，滴加 FITC 标记的抗兔 IgG，避光反应 15 min 后，经流式细胞仪检测细胞表面 CD29、CD34、CD44、CD105 阳性细胞的表达。
2 结 果
2.1 MSCs 的形态学变化
原代培养中，可见细胞以分散、克隆集落方式增殖；第 1~3 天细胞大部分呈圆形、椭圆形生长；第 3~7 天贴壁细胞增多，并逐渐延展生长为多角形、星形或梭形； 7~21 d 贴壁细胞明显增多，并有集落形成，相邻集落融合成片达 80% 以上，细胞排列呈漩涡状，细胞间界限不清，细胞呈长梭形；14~21 d 后，细胞传代，传代后的细胞不以集落方式生长，而是均匀分布长梭形细胞。
2.2 MSCs 各时相点细胞帖壁率
见表 1。
2.3 MSCs 生长曲线分析
实验发现，细胞传代培养 1~2 d，吸光度变化不大，甚至有轻微下降，细胞处于潜伏期，第 3 天起呈对数生长，至第 7 天到达高峰，之后进入平台期，见图 2。
根据计算细胞的倍增时间公式可得：
DT = t ×〔lg2/（lgNt-lgNo）〕= 96 ×〔0.301/ （-0.060+1）〕= 30.8 h
2.4 MSCs 表面标记
流式细胞仪结果显示：CD34、CD45 阳性细胞均为 0.8%；CD29 和 Cd105 阳性细胞数为 99.8%。说明分享获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的特点（见图 3）。
3 讨 论
MSCs 体外培养的生长特点和生物学特性已有较多相关报道。MSCs 在骨髓中的含量极少，约占有核细胞的 0.001%~0.01%[9]，如何获得高纯度、足量的 MSCs，成为 MSCs 应用研究的关键。
目前常用于 MSCs 分离方法有密度梯度离心法[10-11]、贴壁筛选法[12]、免疫磁珠法[13]、流式细胞仪分离法[14]及 Hung 等[15]研究的特制微孔培养板筛选法。采用全骨髓贴壁筛选法，将抽取的骨髓直接置于培养瓶中培养，利用骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性分离细胞，几天后换液观察细胞贴壁情况，这种保留造血干细胞和各种细胞混合培养的方法，由于维持了 MSCs 原始的生活环境，有利于 MSCs 分化，但所得细胞成分复杂， MSCs 纯度不足。单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术对细胞活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，而且实验操作复杂，需要骨髓量大，不易重复，造价较高，一般仅限于在大实验室应用[16]。特制微孔培养板筛选法，可以快速有效分离得到相对同质的 MSCs，利用这种方法可以不用 Percoll 液去除红细胞[17]，但是结果不稳定，特定原料不易大量获取。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，利用Percoll 或淋巴细胞分离液提取单核细胞进行贴壁培养。操作上较贴壁细胞分离法烦琐，得到的细胞数不如后者多，但细胞纯度较后者高。本实验结合密度梯度离心法和贴壁筛选法，利用密度为 1.077 g/L 的 Ficoll 分离液，能有效去除绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。然后利用 MSCs 的贴壁性，逐渐弃掉未贴壁细胞，从而获得足量的 MSCs。
在培养过程中，我们还注意到以下几个环节：①与蒋雯等[18]不同，本实验研究发现，兔 MSCs 原代培养首次换液的时间宜在 4~6 d，过早换液将丢失过多尚未贴壁细胞，因在实验过程中，第 3 天首次换液后，收集旧培养液离心洗涤，再接种仍有细胞大量生长；且原代细胞在培养 14 d~21 d 左右才能达到80% 以上的融合，才能进行传代培养，这可能与我们用的培养基加的胎牛血清浓度不同，蒋雯等用的是 20% 的血清，而我们用的是 10% 的胎牛血清；②培养基中胎牛血清浓度保持在 10% 左右为宜，过低由于缺乏生长因子的刺激，细胞增殖减慢，而过高又因含大量促进细胞生长增殖分化的因子，易引起细胞过早出现老化；③兔 MSCs 原代接种贴壁不良时，可予胶原[19]包被培养瓶，增加细胞的贴壁率；④胰蛋白酶消化细胞时，可先将 PBS 润洗培养瓶 2 次，去除残留血清，更易将贴壁细胞消化下来，且消化时间缩短，不会造成消化时间过长对细胞的损伤；⑤细胞传代时，应注意接种密度，宜按 1:2 比例传代接种，如此细胞才能保持良好的增长趋势，不会因接种密度过稀致增长缓慢且易老化。
目前 MSCs 在生物医学领域有着广泛的应用，然而 MSCs 表面标志由于细胞分离、培养方法和培养时间等的不同而有差异。Pittenger 等[20]认为人MSCs 阳性表面标志是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，阴性表面标志是 CD45、CD34 和 CD14 等造血细胞标志。Hung 等[21]采用带 3 m 孔培养板的装置培养分离得到人 MSC，培养至第 2 代末时阳性表面标志是 CD90、CD44、CD29、CD51，阴性表面标志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者们应用不同的分离扩增方法及不同的方式表达细胞特性，使得对一些研究结果的比较变得困难，阻碍了其在这些领域的应用[22]。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定义了 MSCs 的最低标准： 首先，MSCs 在标准培养条件下必须具备贴壁生长的特点；其次，MSCs 表达 CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表达阴性；第三，MSC 在体外能分化为格根包尔氏细胞、脂肪细胞和成软骨细胞[23]。本实验选择第 3 代细胞行流式细胞仪检测表面抗原显示，阳性表达黏附分子、整合素家族成员等如细胞表面抗原 CD29、CD44、CD105 阳性细胞数占 99.8%，而造血细胞表面标志阴性或极少表达即 CD34 阳性率只有 0.8%，上述结果表明：获得的细胞为非造血类的、符合骨髓间充质干细胞的特点，与资料吻合[12，24]。
通过对兔MSCs 培养方法和表面标识物的进一步研究，本研究建立了一套稳定分离、培养扩增骨髓间充质干细胞的方法，获得足量纯化的 MSCs 并进而研究其作为种子细胞多种疾病提供了实验基础。随着基因工程和组织工程的，骨髓 MSCs 也将在细胞治疗、基因治疗等方面得到广泛应用。本研究设计的缺陷在于，这只是细胞培养的一个初步研究，下一步若对细胞周期及细胞活力进行检测，将对选择最合适代数细胞作为种子细胞的应用提供更有价值的信息。
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