分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制
【摘要】 目的 探讨人工髋关节假体分离出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋关节术后引起骨溶解的作用机理。方法 采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来研究其生物分子学机制。结果 鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂 SP600125和 NF-кB抑制剂MG132 大大抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1 和 NF-кB。结论 钛颗粒诱导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。
【关键词】 人工髋关节置换术 钛颗粒 骨溶解 肿瘤坏死因子
【Abstract】 Objective To study the mechanism of osteolysis after total hip replacement by tumor necrosis factor-α (TNF-α) release in macrophages stimulated with particulate debris from prosthesis. Methods A model of TNF-α release by stimulating macrophages with titanium particles was made and study the mechanism of TNF-α release by Elisa/West blot/EMSA. Results TNF-α was released in murine macrophage stimulated by titanium (Ti) particles and specific inhibitors of JNK (SP600125) and NF-κB (MG132), but not p38 (SB203580) dramatically inhibited Ti-stimulated TNF-α release. Moreover,transcriptional activation of AP-1 and NF-κB was also induced by Ti particles. Conclusion These results demonstrate that Ti particle-induced TNF-α release is mediated through JNK/AP-1 as well as NF-κB pathways.
【Key words】 THR; Ti particles; osteolysis; TNF
人工髋关节置换术后假体周围的骨溶解及随后而来的假体疏松是置换术失败的常见原因。由于假体长时间磨损与腐蚀生成的颗粒碎片导致假体周围形成假膜，这些假膜由肉芽肿形成，它包括巨噬细胞、纤维母细胞、巨细胞及破骨细胞［1，2］。假体周围膜组织的这些细胞受这些碎片颗粒而产生有关骨溶解及假体松动的炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-11及转化生长因子-β［3，4］。通过这些细胞因子的相互作用，破骨细胞被激活吸收骨组织，导致骨溶解及假体松动。
这些炎症因子中，TNF-α是很重要的骨溶解因子。Kimble 等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-кB配位子（RANKLE）受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性［5］。 而且，Ingham 等发现TNF-α又直接促进早破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织［6］。与此同时, Merkel 等通过去除肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因的动物颅骨与PMMA 颗粒接触，发现无骨溶解现象［7］。 这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。 但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来分析TNF-α合成的分子生物学机制。
1 材料与方法
1.1 材料 DMEM培养基，牛胎血清（FBS）来自于Gibco Invitrogen 公司（Rockville.MD）。PD98059、SP600125、MG132 来自于Calbiochem (La Jola CA)。抗磷酸-ERK /JNK/IkBα 抗体来自于Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。测定鼠TNF-α ELISA 试剂盒来自于BioSource international(Madison WI)。EGCG 来自于Sigma (St Louis,MO)。硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于Amershan Biosciences Corperation(Piscataway,NJ)。其余化学试剂来自于Sigma公司。
1.2 细胞培养 RAW264.7 细胞培养在由10% FBS 及1% 青链霉素添加的DMEM 培养基以及5％CO2湿润的37°C空气中，等生长到60%～70%后计数并培养在96孔培养皿（2×104细胞/孔） 或60mm 组织培养皿(2×106细胞皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30min后，再与钛颗粒处理。上清液及细胞收集后用于进一步分析。
1.3 钛颗粒准备 钛颗粒（1～3μm）来自于 Cerac(Milwaukee,WI)。颗粒用25％硝酸及95％乙醇、0.1N氢氧化钠混合液消毒（Ragab et al,1999）。颗粒内毒素由Limulus Amebocyte Lysate 方法（Biowhittaker,Walkersville,MD）测定。
1.4 方法
1.4.1 ELISA （酶联免疫吸附剂测定） RAW264.7细胞（2×104/孔）在PD98059/SP600125/MG132 等抑制剂添加或不添加的情况下用钛颗粒处理。TNF-α 用ELISA 方法（BioSource）来测定。具体如下：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，4℃放置24～48h。洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，37℃，1h。标准品稀释方法：取标准品，溶于100μl标准品稀释液中做1:100稀释为10ng/ml以后再倍比稀释至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，1h。洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或37℃显色15～30min。ELISA读数仪测450nm/650nm处OD值，绘制标准曲线。
1.4.2 Wetern blot(蛋白质印迹) 将RAW264.7细胞用钛颗粒处理后，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150mmol/L NaCl、1NP-40、0.5去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室温下1h，离心10min(13000r/min)，取上清液，检测蛋白浓度。将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3min，分别加入4%～15% 十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45～60min(电压200V)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在90V电压下转移1h，将其置于5%无脂牛奶中1h(去除非特异性染色)后取出，加第1抗体-ERK/JNK/IkBa(抗体稀释液：1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5 Tween 20)于硝酸纤维膜，4℃过夜，漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体，再置室温1h，漂洗3次，用放射自显影法显影，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较。
1.4.3 EMSA(凝胶迁移率实验) Park方法准备细胞核提取液［8］。蛋白浓度用BCA试剂盒测定。凝胶迁移测定方法按Promega 公司说明书进行。7μg 核抽提液与1μg poly d(I-C)含50，000～100，000 cpm 32P标记的AP-1/ NF-κB置25μg的结合缓冲液（10mM Tris.HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM DTT, 和4% glycerol）于室温30min。形成的复合物在0.5xTBE缓冲液(50mM Tris. HCl, pH8.5, 50mM borate,和1mM EDTA)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并凝胶在真空中变干60min后 X 胶片摄影。
1.4.4 统计学方法 统计分析用SPSS11.0并完全随机设计的单因素方差分析。P <0.05具有意义。
2 结果
2.1 钛颗粒刺激后由时间及剂量依赖性释放TNF-α 为确定RAW264.7细胞在何有效浓度的钛颗粒才能释放TNF-α，选择了三种不同浓度的钛颗粒并与RAW264.7细胞混合。取其上清液用 ELISA法测定TNF-α。图1示三种浓度的钛颗粒剂量依赖性释放TNF-α ，图2示0.02% 浓度钛颗粒刺激后时间依赖性释放TNF-α。
2.2 ERK/p38/JNK/NF-кB 抑制剂对RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α的效果 为了解RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α 与哪支细胞信号通路有关，细胞先由ERK/p38/JNK/NF-кB 抑制剂处理后，再受0.002%钛颗粒刺激24h。用ELISA法测定其上清液中的TNF-α。与对照组（651.5±9.3pg/ml)相比，30μM PD98059, 25μM SB203580, 20μM SP600125, and 10μM MG132 各抑制TNF-α 66% (218.2±21.1pg/ml), 20% (550±5pg/ml), 91% (56±6pg/ml) and 92% (51.3±4.7pg/ml) (P<0.01) (见图3) 。其中JNK抑制剂（SP600125）及NF-кB 抑制剂（MG132）显示较强的抑制作用。图3 ERK1/2、JNK及NF-кB抑制剂对RAW264.7
细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α的效果2.3 钛颗粒诱导的JNK/AP-1及NF-кB 通道活化的效果 为了解钛颗粒诱导的TNF-α 释放的分子生物学机制，我们用磷酸化ERK/JNK特异性抗体检测了MAP 激酶。并且，测定IkB 来了解 NF-кB 的活性。当钛颗粒刺激15min 后，诱导磷酸化的ERK。磷酸化的JNK 受刺激1h 后达高峰，随后下降。IkBa受刺激15min 后降解而1h后最显著（见图4）。众所周知，活化的JNK可以c-JUN 磷酸化，继而活化AP-1 转录因子［9］ 。为确定钛颗粒诱导的TNF-α 释放与AP-1/NF-кB活化有无相关，RAW264.7细胞受钛颗粒处理并EMSA 方法测定。由钛颗粒刺激15min及30min 后，明显活化AP-1/NF-кB （见图5）。总之，这些结果表明钛颗粒诱导的TNF-α释放与调节下降与JNK/AP-1及NF-кB 活性有关。
3 讨论
人工关节术置换术后骨溶解及假体松动的发病机制由颗粒碎片激活巨噬细胞并释放TNF-α等炎症因子有关。降低这些炎症因子来阻止假体周围炎症反应的巨噬细胞，从而可以防止骨溶解。TNF-α是免疫防御系统中主要的细胞因子，也是受颗粒刺激的巨噬细胞释放的重要的介质［10，11］ ，因此，它的合成将成为阻止颗粒诱导的骨溶解可能性目标。
对受各种刺激而释放TNF-α已有很多研究。本研究中，证明了RAW264.7巨噬细胞株受钛颗粒刺激后呈剂量及时间依赖性释放TNF-α （见图1）。在TNF-α 启动因子中包含AP-1/Ets/NFAT等不同的转录因子潜在的结合位。这些转录因子对TNF-α 基因活化起重要作用［12］ 。其中，NF-кB是诱导TNF-α 研究较多的转录因子之一［13，14］ 。而AP-1或其他转录因子可能与TNF-α 表现有关［15］ 。实际上，RAW264.7细胞受钛颗粒刺激后诱导JNK/ERK及IkB降解等信号分子活性（见图4）。与此结果相似，JNK及NF-кB药物性抑制剂相当程度上减少钛颗粒刺激而释放的TNF-α （见图3）。然而，我们认为JNK 磷酸化Jun 后活化AP-1是RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而活化的（见图4）。因此，我们试图是否RAW264.7细胞受钛颗粒刺激后AP-1被激活。与我们预期一样，AP-1 被钛颗粒迅速激活,而且,同时激活NF-кB（见图5）。由此，我们可以肯定RAW354.7细胞受钛颗粒刺激产生TNF-α与JNK/AP-1及NF-кB通道有关。
4 结论
此项研究首次证明了钛颗粒诱导的TNF-α 释放不仅与NF-кB通道有关,而且与JNK/AP-1通道有关。因此，我们认为阻止这些通道将对人工髋关节置换术后产生的骨溶解及假体松动具有预防及作用。
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