灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠肾脏损伤保护作用的研究

               作者：肖宫，熊军，罗崇岱，杨可达，张平 肖桂林

【摘要】  目的 探讨灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠肾脏的保护作用。方法 用SD大鼠20只，随机分为4组，分别为：空白组，采用生理盐水灌胃对照；模型组Ⅰ，采用亚稀褶黑菇毒素灌胃造模；模型组Ⅱ，采用亚稀褶黑菇毒素灌胃造模后，用灵芝煎剂灌胃；灵芝组，采用灵芝煎剂灌胃对照。观察大鼠的存活情况、活动情况、尿颜色、尿量、尿红细胞、尿白细胞、尿蛋白、血液生化（尿素氮、肌酐）、NAG酶以及肾脏病理检查等指标。结果 实验所观测的指标包括实验动物的存活情况、活动情况、尿颜色、尿量、尿红细胞、尿白细胞、尿蛋白、血液生化（尿素氮、肌酐）、NAG酶等，模型组Ⅱ与模型组Ⅰ各项指标分别比较，有非常显著差异（P<0.01）；病理形态学检查结果提示，模型组Ⅱ的肾脏组织结构损害较模型组Ⅰ明显减轻。结论 灵芝煎剂对亚稀褶黑菇中毒大鼠肾脏有明显的保护作用。

【关键词】  灵芝煎剂；亚稀褶黑菇；SD大鼠；急性中毒；肾脏保护

    Protective efficacy of Lingzhi decoction on acute renal injury caused by russula subnigricans in rats

    XIAO Gong, XIONG Jun, LUO Chong-dai, YANG Ke-da, ZHANG Ping, XIAO Gui-lin

    (Xiangya medical college, Central South University, Changsha, Hunan 410008, China)

    〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To investigate the protective efficacy of Lingzhi decoction on acute kidney injury caused by russula subnigricans in rats. Methods 20 female SD rats with russula subnigricans were ramdomly divided into 4 groups as follows, normal group, fed with normal saline, model Ⅰ group, with russula subnigricans, model Ⅱ group, with Lingzhi decoction after modeled by russula subnigricans, and fourth group, with Lingzhi decoction only for comparison. Results All the indexes of living condition, behavior, color and volume of urine, RBC, WBC, protein, blood biochemistry(UN, Cr) and β-N-acetyglocosamidase [NAG] in model Ⅱ group were very different compared with model Ⅰ group(P<0.01) ; the damages of the cells and tissues of kidney in model Ⅱ group were apparently much lighter than that in model Ⅰ group with pathological examination. Conclusions The Lingzhi decoction is very effective to protect rat’s kidney damaged by russula subnigricans.

    〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Lingzhi decoction; russula subnigricans; SD rats; acute poisoning ; protecting kidney

    在指导老师临床治疗的基础上[1，2]，为进一步探索灵芝对亚稀褶黑菇中毒肾脏的保护作用，采用亚稀褶黑菇模拟人中毒过程，用大鼠制造中毒动物模型，然后用灵芝煎剂灌胃进行治疗，观察肾脏功能及病理变化情况，以了解灵芝煎剂对亚稀褶黑菇中毒大鼠肾脏的保护作用，验证灵芝对亚稀褶黑菇中毒病人临床解毒作用。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  健康SD大鼠20只，由中南大学动物学部提供，合格证号：SCXK(湘)2006-0004，均为雌性，体质量（200±11）g。

    1.1.2  亚稀褶黑菇  干亚稀褶黑菇子实体15 g（由湖南师范大学毒蕈研究所提供）。

    1.1.3  药物  赤灵芝饮片200 g（由中南大学湘雅中药房提供）。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组  SD大鼠20只随机分为4组：空白组、模型组Ⅰ、模型组Ⅱ、灵芝组，每组各5只。

    1.2.2  灵芝煎剂制备  取赤灵芝饮片200 g浸湿，加蒸馏水至300 mL，煎煮30 min，浓缩至100 mL，即每毫升含生药2 g的灵芝液，冷藏备用。

    1.2.3  亚稀褶黑菇毒素制备  将干亚稀褶黑菇子实体15 g，粉碎加少量蒸馏水浸润，再加蒸馏水15 mL，煮沸3 min，离心5 000 r/min 10 min，取全部上清液；其沉渣再加蒸馏水至15 mL，煮沸3 min，以相同转速和时间离心，取全部上清液。将两次上清液混合一起，浓缩至10 mL，即得每毫升含1.5 g干亚稀褶黑菇实体的毒素液体，冷藏备用。

    1.2.4  动物活动、食量、尿颜色情况观察  采用积分法评估实验动物的活动、食量及尿颜色情况。①活动情况  将动物活动情况积分定为3级：轻度3分，活动如常，主动活泼；中度2分，主动活动，但不活泼；重度1分，不主动活动，有被动活动。②食量情况  根据所剩食物量积分，并定为3级：食量轻度减少3分，所剩食物少于10 g；中度减少2分，所剩食物10~20 g；重度减少1分，所剩食物多于20 g 。③小便颜色  根据小便颜色计算积分，亦定为3级：浅黄或不黄3分，明显黄色至红黄色2分，红黄至红色1分。计算方法：按每天观察情况，得出每天每1项分值，再将每1项3 d分值相加除以3得均值，再将3 d的均值相加用统计学处理得出均数±标准差（ｘ±ｓ）。

    1.2.5  动物喂养  每只动物单笼（代谢笼）饲养，供应食物量为每只动物每天50 g，水不限。供食方法：每日20∶00清洗代谢笼并禁食，次日上午8∶30给食。

    1.2.6  造模方法  ①空白组：每天上午8∶００～９∶００用生理盐水４ mL灌胃；②模型组Ⅰ：第1天上午8∶００～９∶００用亚稀褶黑菇毒素1 mL+生理盐水３ mL灌胃，以后每天于同一时间用生理盐水４ mL灌胃；③模型组Ⅱ：第1天上午8∶００～９∶００用亚稀褶黑菇毒素1 mL灌胃，２ h后用灵芝液４ mL灌胃，以后每天于同一时间用灵芝煎剂４ mL灌胃；④灵芝组：每天上午8∶００～９∶００用灵芝煎剂４ mL灌胃。总疗程为3 d。

    1.2.7  尿标本收集与处置  每日20∶00清洗代谢笼并禁食，用清洁尿液收集瓶收集尿液，次日上午8∶00将尿液收集瓶取出，测定总尿量，分装送检。

    1.2.8  血标本收集与处置  实验结束时，心脏取血2 mL离心取血浆送检。

    1.2.9  病理标本收集与处置  实验结束，处死动物，取肾脏按光镜检查要求用福尔马林液固定标本，24 h后用梯度脱水，透明腊块包埋。标本石蜡包埋冷冻24 h后用石蜡切片机连续冠状切片，厚度为4~5 μm，贴于明胶载玻片。

    1.3  观测指标

    1.3.1  动物一般情况  动物活动、饮食情况、小便颜色。

    1.3.2  动物小便情况  尿量、尿蛋白、尿中红细胞、白细胞、尿N-乙酰-β-D葡萄糖酐酶（NAG酶）。

    1.3.3  血液生化指标  尿素氮，肌酐。

    1.3.4  病理指标  肾脏组织切片用HE染色，光镜检查。

    1.4  统计学分析

    数据采用SPSS11.5统计软件分析处理，计量资料用均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，多组间比较用方差分析。

    2 结果

    2.1  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠存活的影响

    模型组Ⅰ于实验48 h 以后死亡2只，其余所有实验动物至实验结束。

    2.2  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠食量、活动、小便颜色积分的影响

    食量、活动、小便颜色积分模型组Ⅰ，模型组Ⅱ与空白组差异均有统计学意义（P<0.01），模型组Ⅰ与模型组Ⅱ比较差异亦有统计学意义（P<0.01），而灵芝组与空白组比较无统计学差异（P>0.05），见表1。

    2.3  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠尿红细胞、白细胞、尿蛋白动态变化的影响

    空白组及灵芝组尿红细胞、白细胞、尿蛋白指标自始至终均未见异常。模型组Ⅰ实验前无异常，实验24 h，尿中出现红细胞（+～++），白细胞（+），尿蛋白（++）；48 h尿中红细胞（+++），白细胞（+～++），尿蛋白（+++）；72 h为鲜红血尿（++++↑），白细胞（+++），尿蛋白（++++）。模型组Ⅱ实验前无异常，实验24 h，尿中出现红细胞（+），白细胞（0～５/Hp），尿蛋白（-～+）；48 h尿中红细胞（0～4/Hp），白细胞（0～4/Hp），尿蛋白（-～+）；72 h尿红细胞（0～3/Hp），白细胞（0～3/Hp），尿蛋白（-～+）。

    2.4  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠尿量的影响

    大鼠尿量实验前无差别，实验进行24、48、72 h时，模型组Ⅰ、模型组Ⅱ尿量与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01）；模型组Ⅰ与模型组Ⅱ比较差异也有统计学意义（P<0.01）。而灵芝组与空白组比较差异无统计学差异（P>0.05），见表2。

    2.5  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠NAG酶的影响

    实验前，24、48、72 h NAG酶动态变化  实验前各组动物NAG酶数据比较无差异。实验24、48、72 h后NAG酶模型组Ⅰ、模型组Ⅱ与空白组差异有统计学意义（P<0.01）；模型组Ⅰ与模型组Ⅱ比较差异亦有统计学意义（P<0.01）。而灵芝组与空白组比较差异无统计学差异（P>0.05），见表3。

    2.6  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠血浆BUN、Cr结果的影响

    实验结束时血浆BUN、Cr结果，模型组Ⅰ、模型组Ⅱ与空白组比较差异有统计学意义（P<0.01）；模型组Ⅰ与模型组Ⅱ比较差异亦有统计学意义（P<0.01）；而灵芝组与空白组比较无统计学差异（P>0.05），见表4。

    2.7  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠肾脏组织病理改变影响

    2.7.1  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠肾脏整体外观影响  肉眼观察：模型组Ⅰ的大鼠肾脏体积明显缩小，质地变软，充血，颜色变深。模型组Ⅱ大鼠肾脏体积缩小不明显，质地较软，充血，颜色较中毒组浅。其余两组肾脏体积质地颜色均正常。

    2.7.2  灵芝煎剂对亚稀褶黑菇急性中毒大鼠肾脏组织病理改变影响  光镜观察：①空白组低倍镜所见肾组织结构清楚，肾小球系膜细胞稍增生，系膜区稍增宽，肾小管上皮细胞正常；②空白组高倍镜下所示肾小球结构完整，肾小球系膜细胞稍增生，系膜区稍增宽；③模型组Ⅰ低倍镜所见肾组织结构有明显破坏，充血，肾小球系膜细胞明显增生，系膜区明显增宽，肾小管上皮细胞明显浊肿；④模型组Ⅰ高倍镜下所示肾小球结构破坏，肾小球系膜细胞明显增生，系膜区明显增宽；⑤模型组Ⅱ低倍镜所见肾组织结构清晰，少量充血，肾小球系膜细胞增生，系膜区稍增宽，可见少量肾小管上皮细胞浊肿；⑥模型组Ⅱ高倍镜下所示肾小球结构完整，肾小球系膜细胞增生，系膜区稍增宽；⑦灵芝组低倍镜所见肾组织结构清楚，肾小球系膜细胞稍增生，系膜区稍增宽，肾小管上皮细胞正常；⑧灵芝组高倍镜下所示肾小球结构完整，肾小球系膜细胞稍增生，系膜区稍增宽。见图1。

    3 讨论

    亚稀褶黑菇[3](R.subnigricans)又名亚黑红菇、火炭菇、毒黑菇，内含胃肠型、神经型、溶血型和细胞毒型毒素，中毒后临床症状发作快，是一种快作用毒素。通过光谱和化学方法确定了它的有毒作用部分为红菇素Russuphelin-A、B、C、D、E、F等，是一类氯化苯基醚类物质。人类误食中毒后迅速引起全身多系统损害，尤其是肾损害极为明显[4]，中毒者一般在72 h内死亡，最快者能在6 h左右死亡。虽然亚稀褶黑菇的毒理作用尚不清楚，但已有的动物实验证实亚稀褶黑菇菌可在数小时内使动物死亡，在死亡动物的分析中发现，其肾脏细胞损害最为突出。

    灵芝Ganoderma Lucidum，亦名灵芝草、瑞草，素有“蕈王”之称，是我国传统的名贵中药材。味甘性平，无毒，入肺、心、脾三经。主要功能是益气血，安心神，健脾胃，有虚劳、心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘等作用。研究表明灵芝含有多种糖类、氨基酸类、肽多糖、萜类、酸类、醇类、甾类等多种物质。实验研究表明[5]，灵芝对全身多器官系统都有调节作用，如对神经系统、消化系统、心血管系统、呼吸系统等多系统的多种疾病有较好的治疗作用，并有资料表明灵芝可对小鼠脏器中毒有一定的保护作用。

    本研究证实：（1）亚稀褶黑菇毒素有较强的毒性，中毒模型组死亡2只动物，对照组无死亡。（2）灵芝在对抗亚稀褶黑菇毒性反应方面有明显作用，结果表明：动物存活、活动情况、尿颜色，模型组Ⅱ明显优于模型组Ⅰ；尿素氮（BUN）、肌酐（Cr），模型组Ⅰ明显增高，模型组Ⅱ中毒后亦升高，较空白组及灵芝组高，但低于模型组Ⅰ。（3）在尿红细胞、白细胞、尿蛋白及尿量的动态变化过程中，模型组Ⅱ与模型组Ⅰ比较，模型组Ⅰ尿红细胞、白细胞、尿蛋白随时间推移进行性增加，尿量则进行性减少，而模型组Ⅱ中毒后尿红细胞、白细胞、尿蛋白仅一过性升高（24 h），以后迅速下降，尿量在24 h后，逐渐恢复接近对照组水平。其结果提示模型组Ⅱ损伤较模型组Ⅰ为轻，体现了亚稀褶黑菇对大鼠肾脏的损害作用及灵芝对其损伤保护作用。（4）目前认为NAG酶是反映肾脏急性损伤的敏感指标，NAG酶水平的高低直接反映肾脏损害的程度。本研究表明，模型组Ⅰ的NAG酶水平明显高于其它3组，而且随着实验时间呈进行上升趋势；而模型组Ⅱ的NAG酶明显高于空白组、灵芝组，但明显较模型组Ⅰ低，而且升高呈一过性，24 h后明显下降。（5）病理切片结果显示，模型组Ⅰ肾脏组织结构有明显破坏，表现明显充血，肾小球系膜细胞明显增生，系膜区明显增宽，肾小管上皮细胞高度浊肿。而模型组Ⅱ虽也表现同样的损伤的迹象，但较模型组Ⅰ要明显减轻，只是表现了肾脏少量充血及可见少量肾小管上皮细胞浊肿，无明显结构破坏。

    以上研究数据说明灵芝煎剂对急性亚稀褶黑菇中毒SD大鼠肾脏具有较好的保护作用。

【】
  [1] 肖桂林，刘发益，陈作红，等. 灵芝煎剂治疗亚稀褶黑菇中毒患者的临床观察[J]. 中西医结合杂志，2003，23（4）：278-280.

[2] 肖桂林，陈作红，李湘民，等.灵芝煎剂治疗鹅膏毒菌中毒103例临床观察[J]. 湖南中医药大学学报，2006，26（5）：44-45.

[3] 陈建魁，胡 斌，刘晓晴，等.NAG酶的测定及在药物肾毒性检测中的应用[J]. 军事医学院院刊，1997，21（3）：193.

[4] Takahashi A， Agatsumat T， Chta T， et al. Russuphelins B，C，D，E and F， new cytotoxic substances from the mushroom Russula subnigricans Hongo[J]. Chemical and Pharmceutical Bulletin(Tokey)， 1993，41（10）:1 726-1 729.

[5] 国家中药管理局.中华本草(精选本上册)[M].上海:上海科学技术出版社,1998:173.