5?氟尿嘧啶对人胃癌细胞超微结构和GSTπ表达的影响
作者：张江兰 薄爱华 吴靖芳 任君旭
【摘要】 目的：探讨5?氟尿嘧啶对人胃癌细胞的结构和GSTπ表达的影响。方法：在人胃癌BGC?823细胞株培养液中加入5?氟尿嘧啶，继续培养5h或10h，然后用HE、免疫组化染色和铀?铅染色。光镜、电镜下观察。结果：10h组胃癌细胞外型畸变、细胞器破坏严重；GSTπ灰度发生变化。结论：5?氟尿嘧啶作用10h对人胃癌细胞超微结构及GSTπ基因表达有明显影响。
【关键词】 胃肿瘤;免疫组织化学;5?氟尿嘧啶
【ABSTRACT】 Objective:To study the influence of 5?Fliorouracil on structure of human gastric cancer cells and the expressions of GSTπ.Methods:5?Fliorouracil was added to culture medium of BGC?823 gastric cancer cells and continuously cultured for 5h or 10h,then the human gastric cancer cells were stained with haematoxylin? Eosin(HE)、dyed with immunohistochemical method and acid U?lead citrate,which was observed under light and electiom microscope.Results:BGC?823 cells,features developed by aberration and the oraganells were destructed severely in experimental group of 10 hours,and the ash of GSTπ was changed.Conclusion:The influence of 5?Fliorouracil on ultrastructure and the expressions of GSTπ in 10 hours group was obvious.
【KEY WORDS】 Stomach Neoplasms,Immunohistochemistry,Research,5?Fliorouracil
5?氟尿嘧啶(5?FU)是一种嘧啶拮抗剂，它是临床上最常用的实体瘤的化疗药物之一，特别是消化道癌和乳腺癌治疗效果好。对卵巢癌、宫颈癌、肺癌、绒毛膜上皮癌等也有效。我国是胃癌高发地区之一，5?FU是治疗进展期胃癌的重要药物。目前虽然人们对5?FU抗癌机制的认识已逐渐深入，但关于5?FU对癌细胞超微结构及基因表达的影响报道极少。为了探讨5?FU抗肿瘤的作用途径及对GSTπ表达的影响，我们利用细胞培养S?P免疫组化染色技术，5?FU作用5h和10h后，对人胃癌细胞超微结构GSTπ表达状况进行研究，为深入认识5?FU的作用途径提供依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料 5?氟尿嘧啶由深圳万乐药业有限公司生产。BGC?823胃癌细胞株由北京肿瘤研究所提供。S?P免疫组织化学试剂盒及兔抗人GSTπ抗血清和DAB显色剂由北京中山生物技术公司提供。
1.2 方法 将5×104/mL浓度的BCG?823胃癌细胞置于无菌96孔板和6孔板中，置CO2培养箱中培养24h，在6孔板中加入消毒盖玻片，使细胞贴壁生长（爬片）。将6孔板中培养的癌细胞分对照组不加5?FU培养，实验组加入5?FU注射液15μL(含0.375mg)，然后继续37℃,培养5h或10h。取出贴壁癌细胞。4%多聚甲醛固定30min,常规S?P法染色。阴性对照用PBS代替Ⅰ抗；阳性对照用已知胃癌阳性切片。将96孔板中培养细胞在加药后5h或 10h收获，戊二醛固定，分别石蜡切片（HE染色）、常规制作超薄切片和铀?铅染色，用光镜和JEM100XⅡ型电镜观察。
1.3 统计学处理 利用北航医学图象分析管理系统软件，每组记数100个阳性细胞检测其着色灰度，以灰度表示着色深浅（深者灰度值低，浅者灰度值高）。SPSS软件进行方差分析后，进行独立样本t检验。
2 结果
2.1 胃癌细胞形态和超微结构的变化 HE染色后光学显微镜下观察对照组BGC?823细胞呈梭形、多边形；胞核多位于中央，呈圆形、椭圆形，染色呈紫兰色，其边界清晰，核仁可见，胞质均匀，多呈弱嗜酸性。实验组5h组BGC?823癌细胞的胞质突减少，甚至消失，很多细胞周边多呈毛刺状，胞质空泡增多，少数癌细胞膜已不完整，胞质溢出，胞核处于偏位；胞核多呈固缩状态，着色较深。实验10h组，大部分癌细胞胞质消失，裸核多见，少部分癌细胞质水肿，HE染色时胞核固缩。
电镜下5h组，局部细胞器减少，主要是线粒体和游离核糖体减少，胞质中有低密度空泡出现，并见扩张的内质网出现。10h组，线粒体水肿基质变空，嵴变短或消失，可见巨大线粒体及膜断裂；滑面内质网囊泡及分支小管增多，甚至呈灶状聚集；粗面内质网核糖体减少或缺如，可见池内隔离；次级溶酶体增多；有些细胞质膜断裂或缺损，使胞核裸露。
2.2 免疫组织化学染色结果 GSTπ阳性物质呈黄色或棕黄色，分布在正常胞质和突起中，以核周围区着色较深，胞核不着色。实验5h组许多细胞胞质着色变浅或变化不明显，而胞核着色更深。实验10h组细胞核，胞质着色变浅（详见表１）。表1 5?氟尿嘧啶对GSTπ表达的影响（灰度值）注:与对照组相比△P<0.01，△△P<0.01；与实验5h组相比*P<0.01
3 讨论
5?氟尿嘧啶（5?FU）于1957年由Dusechinsky等合成，为抗代谢抗癌药物，其化学结构式是在尿嘧啶第5位碳上的氢原子代之氟原子。5?FU药物作用靶点在所有细胞内为固有的胸腺嘧啶合成酶（TS）,TS主要催化一磷酸脱氧尿嘧啶（dUMP）甲基化生成一磷酸脱氧胸腺嘧啶（dTMP），后者是DNA合成的主要原料。5?FU在细胞内的活性产物5FdUMP与TS形成紧密的共价结合，抑制TS酶促活性，进而使dTMP合成受阻[1]，影响DNA和RNA的生物合成，对细胞增殖各期都有毒性作用，尤其是S期[2]，导致细胞核损伤和死亡。临床上研究也提示5?氟尿嘧啶术前静脉化疗可诱导胃癌细胞凋亡,并有效抑制胃癌细胞增殖[3]。
本实验结果显示，5?FU作用5h，BGC?823细胞突起减少，胞质中空泡增多，呈水肿状个别细胞膜破裂，胞质溢出，胞核固缩，着色加深；作用10h，则很多细胞破裂，孤立裸核多见。其原因与5?FU抑制DNA和RNA的合成有关。
GSTπ广泛存在于人体和动物细胞的胞浆，具有多种形式的同工酶，与肿瘤的关系极为密切[4]。有提示GST?π可作为检测胃癌发病的指标[5]。GSTπ具有催化机体内有害物质与谷胱甘肽相结合，并以非酶结合方式将体内各种有毒物质、致癌剂等从体内排出，起到解毒的作用。同时GSTπ具有抗过氧化物刺激的作用及参与调节某些激酶活性，而阻断细胞凋亡途径等功能[6,7]。姚凡等研究提示GST πmRNA表达与胃肠癌内在性耐药有关[8]。
5?FU作用于癌细胞后，DNA合成和RNA多聚酶活性受到抑制，从而GSTπ基因活性也受到抑制，导致细胞毒性物质降解及排泄受到障碍，细胞内毒性物质的堆积必然加重5?FU造成的细胞多种生理活性受阻，和细胞结构发生一系列变化，最终导致核膜破裂及细胞死亡。
总之，5?FU对癌细胞的杀伤作用在5h组尚不明显，主要表现为癌细胞应激性变化，GSTπ合成功能活跃，以对抗5?FU对癌细胞的杀伤作用。10h时，5?FU的杀伤作用已明显体现，细胞形态多畸性变、GSTπ基因表达受到抑制，甚至导致细胞死亡。同时也提示了5?FU对胃癌细胞形态和基因表达影响的复杂性和时间依赖性。
【文献】
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