新城疫病毒体外诱导S180细胞凋亡的实验研究
作者：蒋丽娜 孙黎 程建贞 罗强 翟登高
【摘要】 目的：探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)体外对S180肉瘤细胞（简称S180）生长有无抑制和诱导细胞凋亡作用。方法:取培养至对数生长期的S180细胞浓度为5×104/mL和1×106/mL分别接种于96孔板和50mL培养瓶中，加入不同浓度的NDV(1∶20、1∶10、1∶5)作用24h，分别用MTT法检测NDV对S180瘤细胞的生长抑制作用,荧光显微镜和琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：经上述不同浓度的NDV作用24h，对S180细胞生长的抑制率依次为10%、26%、39%，各实验组吸光度值（A490）与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。荧光显微镜观察实验组培养的S180瘤细胞，出现细胞核固缩及凋亡小体，琼脂糖凝胶电泳见DNA梯形条带。结论：NDV对体外培养S180细胞增殖有明显抑制作用，可诱导S180细胞凋亡。
【关键词】 新城疫病毒；细胞凋亡;电泳/琼脂凝胶
【ABSTRACT】 Objective:To investigate whether the Newcastle disease virus can inhibit proliferation of S180 cells and/or induce apoptosis of the cells in vitro.Methods:S180 cells（5×104/mL）were cultured at mid?exponential phase and planted in 96 well plates with 100μL each and in 50mL culture bottles,1.5mL each.The cells were treated for 24 hours with different concentrations of Newcastle disease virus.Growth inhibition rate was measured by MTT method.Apoptosis was detected by the following ways:fluorescence microscopy with Annexin V?FITC staining was used for observing the change of cell morphology，agarose electrophoresis was used to detect the DNA changes and observe sub?diploid.Results:Newcastle disease virus could inhibit proliferation of s180 cells.The inhibition rates for S180 cells treated with Newcastle disease virus were 10%,26%，39% under the Newcastle disease virus concentrations of 1∶20、1∶10、1∶5 respectively,with a significant difference to that of the control（t=3.606,P<0.05；t= 4.327，P<0.05；t=4.321,P<0.05）.Cell contraction and apoptotic bodies were observed under fluorescence microscope.DNA fragment was shown through agarose electrophoresis.Conclusion:Newcastle disease virus can inhibits proliferation and induces cell apoptosis in S180 cells in vitro.
【KEY WORDS】 Newcastle disease virus,Apoptosis,Electrophoresis/Ager Gel
肿瘤的发生不仅与细胞的过度增殖有关,而且与细胞凋亡受抑制从而使已转化的细胞生存期限延长有关。细胞凋亡具可诱导性,因此,诱导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤的一大热点[1]。近年来，关于NDV感染诱导肿瘤细胞凋亡报道比较多，而对于S180细胞凋亡的诱导作用报道较少。本实验研究了NDV体外感染S180细胞的影响，探讨NDV的抗肿瘤作用，旨在为更深入研究NDV抗肿瘤作用机制，为某些肿瘤的治疗提供依据[2]。
1 材料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 病毒制备
新城疫病毒(NDV)弱毒株由预防医学院病毒学研究所提供，病毒按常规方法在鸡胚传代。取孵育9～11d的鸡胚，将效价为1∶800 以上的病毒液稀释100倍，取0.1mL注入尿囊腔内培养72h，取出鸡胚4℃冰箱过夜。次日收集尿囊液，按常规血凝实验方法检测血凝效价，NDV为1∶800（++），所有病毒存于-80℃备用。
1.1.2 细胞株
小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞由河北医科大学实验动物部提供。
1.1.3 试剂 四甲基氮噻唑蓝（MTT）为北京市普京康生物工程技术有限公司进口分装产品。DMEM培养基为美国Gibco公司产品。新生牛血清购自天津市川页生化制品有限公司。凯基Annexin V?FITC细胞凋亡检测试剂盒为深圳晶美生物有限公司产品。琼脂糖、100bpDNA标志物购自郑州羚锐制药有限公司。其他试剂为国产分析纯。
1.1.4 仪器 酶标仪（美国 Stat Fax?2100），荧光显微镜（日本Olympus），流式细胞仪（美国 FACSA ria），紫外投射仪（ZF型，上海康华生化仪器制造厂）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 小鼠肉瘤S180腹水型肿瘤细胞株经小鼠腹腔传代，无菌抽取腹水瘤细胞,置于含15%灭活胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2培养箱中进行培养,当细胞生长至对数期加入不同浓度的NDV处理。
1.2.2 MTT比色法观察S180瘤细胞抑制率 取对数生长期浓度为5×104/mL的S180瘤细胞，接种于96孔培养板上，每孔100μL。用DMEM培养液把病毒稀释成1∶20、1∶10、1∶5三个不同浓度，并分别加入96孔培养板（100μL/孔），每组设4个重复孔，对照组加入等体积培养液，均培养24h。实验终止前4h每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，培养结束时用吸管轻轻吸弃上清夜，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100μL，15min后以酶标仪检测吸光度（A490值），按公式S180细胞抑制率。抑制率（%）=（1-实验组平均A490值/对照组平均A490值）×100%。
2008年6月蒋丽娜等：新城疫病毒体外诱导S180细胞凋亡的实验研究第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期1.2.3 荧光显微镜观察S180瘤细胞凋亡 取对数生长期S180细胞（浓度为1×106/mL）分别接种于4只50mL的培养瓶，每瓶1.5mL，实验组分别加入上述不同浓度的病毒液1.5mL，对照组加入1.5mL的培养基。培养24h后，1500×g离心7min，收集S180细胞，严格按照凯基Annexin V?FITC细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行，荧光显微镜观察凋亡细胞并拍照（图2）。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析 按1.2.3方法收集S180细胞，用PBS洗涤3次，最后一次移入1.5mL EP管中，加裂解液615μL 70℃水浴震荡15min，15000g离心15min重复2次，取上清液500μL加1000μL的无水乙醇使DNA析出，15000g离心15min，最后用20μL TE缓冲液（pH=7.4）溶解DNA。电泳前，用RNA酶（10g/L）消化30min，2%琼脂糖凝胶电泳60min，EB染色，紫外透射仪观察并拍照（图3）。
1.3 统计学分析
所有数据均采用SPSS12.0统计软件进行分析。各组实验统计资料以均数（x±s）表示，组间显著性差异采用t检验馈。
2 结果
2.1 NDV对S180瘤细胞增殖的抑制作用
分别以1∶20、1∶10、1∶5三个不同浓度的病毒液作用S180细胞24h，对S180细胞的生长有不同程度的抑制作用，且随着病毒浓度的增加，对S180细胞抑制率也增加，分别为10%、26%、39%，各实验组A490与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）（见表1和图1）。表1 不同浓度的NDV对S180瘤细胞的生长抑制作用荧光显微镜观察，对照组S180瘤细胞颜色均匀，无亮色凋亡小体，细胞的胞膜完整（图2 A）。加入NDV的实验组，部分细胞出现亮色凋亡小体，细胞核固缩、破裂，细胞膜发泡等现象。三个不同浓度组比较，凋亡细胞数量随NDV的浓度递增而增加（图2 B图2 不同浓度NDV诱导S180瘤细胞凋亡的荧光显微镜下观察情况(10×10)
A为对照组(未加NDV),B～D为实验组。
其中B图NDV浓度为1∶20,C图NDV浓度为1∶10,D图NDV浓度为1∶5～D），表明NDV能诱导S180瘤细胞凋亡，凋亡程度而且与NDV浓度呈正相关。
2.3 NDV对S180瘤细胞基因组的影响
图3 琼脂糖凝胶电泳显示S180凋亡细胞DNA呈梯状带
M:100 bp NDA标志物,1:对照组(未加NDV),2～4:实验组,
2:NDV浓度1∶20,3:NDV浓度1∶10,4:NDV浓度为1∶5凋亡的特征之一是基因组断裂出现180～200bp的整数倍DNA片段,可用琼脂糖凝胶电泳检测，不同浓度NDV感染S180瘤细胞24h后基因组电泳呈现梯状条带(如图3),说明NDV能引起S180瘤细胞凋亡。
3 讨论
NDV是副黏病毒科副粘病毒属成员,其基因组为约15kb的单股负链RNA,主要感染禽类,对人类可引起发热,偶尔侵害角膜[3]。
研究显示[4～6],NDV对许多肿瘤的生长均有抑制作用,在肿瘤细胞中的复制量是在正常细胞中的1万倍[7～9];而且仅特异性地杀伤肿瘤细胞,对正常的细胞没有毒副作用。
我们的研究用不同浓度NDV感染培养的S180瘤细胞，显示在一定的浓度范围内有抑制S180瘤细胞生长的作用，并引起凋亡。说明NDV引起S180瘤细胞凋亡是极重要的抗肿瘤作用机制之一。这为我们深入研究其凋亡机制，采取对应的措施提供了理论依据。
NDV 治疗肿瘤有许多优点[10,11]，NDV 免疫患瘤机体后可提高机体的免疫力,具有明显的抗肿瘤的作用,对人危害小,无副作用,治疗方法简单,操作方便,成本较低,易于被接受和推广应用。随着对其研究的深入,它有望成为临床治疗肿瘤的一种有效的生物治疗手段。
【】
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