糖基化终产物对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及纤维连接蛋白基因表达的影响

【摘要】  目的：探讨体外培养条件下糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子 (CTGF)及纤维连接蛋白（FN）基因表达的影响。方法：用不同浓度体外制备的AGEs干预系膜细胞及同一浓度的AGEs干预细胞不同时间。应用RT?PCR检测细胞中CTGF和FN的mRNA水平。结果：随着AGEs干预浓度的增加或干预时间的延长，系膜细胞CTGF和FN mRNA水平与对照组相比显著上升。结论：AGEs可导致人肾小球系膜细胞CTGF和FN mRNA的表达增加，在糖尿病肾病的发生、中起一定作用。

【关键词】  糖基化终产物；肾小球系膜细胞；糖尿病肾病；结缔组织生长因子；纤维连接蛋白

 糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性微血管并发症之一，其特征性病理变化是肾小球系膜区扩大、毛细血管基膜增厚、细胞外基质大量积聚而最终导致肾小球硬化。大量研究表明糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）在DN的发生发展过程中起了重要作用[1]，其可通过诱导各种生长因子的过表达而加速肾脏纤维化。本研究拟通过研究体外制备的AGEs对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连接蛋白（FN）表达的影响，探讨AGEs在肾小球纤维化中的作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，AMRESCO产品)，D?葡萄糖(分析纯，重庆北培化学试剂厂产品)，人肾小球系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC，阮雄中博士惠赠），DMEM、HEPES（ GIBCO公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），TRIZOL、RT?PCR试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis）、DNA Marker SM0241、Taq酶均购自 Fermentas公司，CTGF、FN及β?actin引物（上海申能博彩生物工程公司）,琼脂糖（MDBio公司）。引物序列及扩增片断分别为：β?actin,上游5′?CCCTG GACTTCGAGCAAGAGAT?3′，下游5′?GTTTTCTGCGCA AGTTAGG?3′，531bp；CTGF,上游5′?AAATCTCCAAGC CTATCAAG?3′,下游5′?TTCATGCCATGTCTCCGTACA?3′，270bp；FN,上游5′?TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA?3′,下游5′?CTGCAAGCCTTCAATAGTCA?3′，346bp。

　　1.2  方法

    1.2.1  AGE?BSA的制备  将葡萄糖用0.02mol·L -1 PBS溶液(pH7.4)配成0.5mol·L-1溶液，加入BSA (浓度为5.0g·L-1)，过滤除菌，37℃孵育3 个月。用PBS 溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA 除不加葡萄糖外，同上条件制备。荧光光谱扫描鉴定。

    1.2.2  细胞培养及分组  细胞培养在DMEM培养液(含10mmol·L-1  Hepes、0.37% NaHCO3、100U·L-1青霉素、100U·L-1链霉素及10%灭活小牛血清)中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2中饱和湿度下培养，将处于对数生长期的细胞按1×104 移入六孔板中孵育至细胞次全融合。分别用浓度为50、100、200及400mg·L-1 的AGE?BSA 和BSA 干预24h，然后选取敏感浓度200mg·L-1的AGE?BSA 和BSA 分别干预0、24、48和72h，并以无血清培养基(DMEM)作为空白对照。

    1.2.3  RT?PCR检测CTGF、FN mRNA的表达  各组至培养终点后以Trizol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的A260 nm与A280 nm的比值在1?60～1.80之间，1%的甲醛变性凝胶电泳证实所提RNA的完整性较好(有28s与18s两条电泳带,其光密度比值等于2.0)。以2μg总 RNA为模板逆转录合成 cDNA，用特异性引物对逆转录产物进行半定量PCR。以β?actin作为内参引物,在同一体系中进行CTGF、FN mRNA和β?actin共同扩增。扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共27个循环；最后72℃延长7min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用GelDoc?It imaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，使用Smartview分析软件对RNA条带进行密度扫描分析，得出目的条带与内参照条带的吸光度比值。至少重复3次独立的RT?PCR全过程。

　　1.3  统计学分析数据以x-±s表示，使用SPSS11.5统计软件分析数据，采用one?way ANOVA进行显著性检验，差异显著性设定为P<0.05。

　　2  结    果

    2.1  不同浓度AGE?BSA对HRMC CTGF、FN mRNA表达的影响RT?PCR结果显示，正常情况下HRMC就有少量CTGF、FN mRNA表达。加入不同浓度（50、100、200、400mg·L-1）的AGE?BSA 48h后，CTGF、FN mRNA水平较相应浓度的BSA组和对照组均明显升高（P<0.01），随着AGE?BSA浓度的增加，CTGF、FN mRNA表达进一步增高；不同浓度(50、100、200、400mg·L-1)的BSA干预细胞48h后，CTGF、FN mRNA水平较对照组相比无显著差异（P>0.05）。见表1、图1。 表1  不同浓度AGE?BSA对HRMC的CTGF、FN mRNA水平的影响

　　2.2  不同时间AGE?BSA对HRMC CTGF、FN mRNA表达的影响RT?PCR结果显示，加入AGE?BSA（200mg·L-1）24h后CTGF、FN mRNA的表达水平较BSA组和对照组均显著增高（P<0.01），且随着时间的延长，CTGF、FN mRNA的表达进一步增加，而BSA组与对照组相比无显著差异（P>0.05）。见表 2、图2。   

    2.3  PCR产物测序序列结果与GenBank中人CTGF cDNA、FN cDNA序列核对完全吻合。

　　3  讨    论

　　DN是糖尿病的并发症之一，30%～50％的糖尿病患者合并DN，早期肾小球肥大，晚期系膜区细胞外基质积聚、肾小管间质纤维化，最终导致肾小球硬化[2]。有资料表明，AGEs在DN发生、中的一个重要致病机制是影响肾脏固有细胞细胞因子的分泌，在这些细胞因子中，CTGF是肾脏纤维化过程中的重要调节因子，FN是细胞外基质的代表成分之一，也是构成肾小球硬化的重要成分。本研究中通过给予体外合成的AGE?BSA干预体外培养的HRMC，观察了AGE?BSA对培养的HRMC CTGF、FN mRNA表达的影响。结果发现AGE?BSA能明显诱导HRMC CTGF、FN mRNA的表达，并随着AGE?BSA浓度的增加和干预时间的延长，CTGF、FN mRNA的表达进一步增强。CTGF在体内广泛存在，研究表明CTGF在肾组织中含量最高[3]。在以基质增生和纤维化病变为特征的肾小球疾病，包括DN，CTGF表达显著增加。在DN活检标本中检测到CTGF mRNA表达显著增高，尤其是肾小球实质细胞，包括肾小球系膜细胞、内皮细胞及毛细血管外增殖区域、球旁纤维化区域，其升高程度与肾小球硬化、肾小管间质纤维化程度密切相关[4]。Twigg等[5]发现STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏，CTGF mRNA和蛋白的表达明显增加，AGEs的沉积和FN的产生也显著增加，此外该实验室的研究还表明，AGEs还可使皮肤成纤维细胞的CTGF表达增加[6]，且AGEs诱导的ECM蛋白、FN表达呈CTGF依赖性，提示AGEs诱导的FN表达可能与CTGF有联系。还有研究显示AGEs干预糖尿病大鼠后，肾脏CTGF mRNA、TGF?β1 mRNA及其蛋白表达增加。新近有学者[7]发现肾小管上皮细胞中CTGF表达增高，并且在肾间质纤维化的过程中起了重要作用。我们课题组的研究也表明[8?9]：AGEs是CTGF的重要诱生物；AGEs以浓度和时间依赖方式增加体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)CTGF mRNA和蛋白表达；动物模型实验也发现糖尿病大鼠血清AGEs水平明显增高，肾皮质、主动脉CTGF mRNA表达明显增加。至于AGEs诱导的系膜细胞CTGF mRNA表达的机制目前尚不明确，其机制可能涉及多种细胞间信号的相关关系。最近Twigg等[10]发现，AGEs可与其相应受体结合通过TGF?β途径诱导CTGF表达增加，并通过蛋白激酶C(PKC)通路增加FN的表达。同时体外实验发现，经AGEs干预的小鼠系膜细胞FN和Col Ⅳ表达增强，后者能完全被抗CTGF抗体阻断。AGEs干预也能引起TGF?β1和CTGF mRNA明显增加，但是TGF?β1 mRNA表达被siRNA阻断或TGF?β1蛋白被抗TGF?β1抗体中和，都不能明显预防由AGEs干预所引起的CTGF mRNA和蛋白的表达增强。这些结果提示AGEs诱导的CTGF表达主要通过一种TGF?β1依赖性途径，当然也可能存在其他通路。本研究结果发现AGEs能明显诱导CTGF及FN 表达增加，提示AGEs可能通过诱导CTGF、FN mRNA表达上调引起细胞外基质的过度积聚，从而在DN的发生发展中起重要作用。AGEs诱导HRMC的CTGF、FN表达增加可能是DN发病机制中的一个重要途径，有效地阻止这一过程在预防DN的发生发展中可能有重要意义。

【】
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[6]TWIGG S，JOLY A，CHEN M，et al.Connective tissue growth factor/IGFBP?rP2 is a mediator in the induction of fibronectin by advanced glycosylation end products in human dermal fibroblasts[J].Endocrinology,2002，143：1260?1269.

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[10]TWIGG S，CHEN M，JOLY A，et al.Advanced glycosylation end products up?regulate connective tissue growth factor (insulin?like growth factor?binding protein?related protein?2) in human fibroblasts：a potential mechanism for expansion of extracelluar matrix in diabetes mellitus[J].Endocrinology,2001，142：1760?1769.