壳聚糖纳米颗粒的制备及其质粒转染研究

【摘要】  目的：研究壳聚糖纳米颗粒在体外和体内实验中的转染能力。方法：用亚硝酸钠降解壳聚糖的方法制得低分子质量壳聚糖，用zeta电位仪测定粒径、多分散度、zeta电位，并使用乌式黏度计法测定其相对分子质量;通过静电吸附复合绿色荧光蛋白表达质粒pIRES?eGFP（报告基因），采用琼脂糖凝胶电泳分析载体与DNA结合能力;用体外和体内基因转染实验,评价纳米颗粒的转染能力。结果：制得的壳聚糖粒径200 600nm，多分散度最好的达到0.005，zeta电位0.89mV，相对分子质量7.7×107 ,粒径250nm。体外对3T3细胞的转染实验显示，该壳聚糖具有一定的转染效率；体内对Balbc57/BL6小鼠的股四头肌肌肉的转染实验显示，肌肉组织中有大量绿色荧光蛋白的表达，并且在炎症部位尤为明显。结论：本研究制备的壳聚糖，能够在体外和体内均实现有效转染，为基因提供了一种潜在的载体。

【关键词】  壳聚糖 基因治疗 细胞转染 载体

    基因治疗的应用之一就是在体内由DNA直接产生相应的、有治疗作用的蛋白质。基因治疗可以通过控制细胞周期蛋白质或者细胞因子等蛋白质的表达，用于肿瘤和免疫性疾病等许多获得性疾病的治疗[1?2]。壳聚糖是一种氨基多糖，由几丁质经脱乙酰化后得到。几丁质是海洋产业的副产品，所以产量丰富。尤为重要的是，它具有良好的生物相容性、生物可降解性和低免疫原性。因此，它正作为一种继磷酸钙、脂质体之后的新型非病毒载体，被人们广泛关注[3?4]。壳聚糖等电点偏碱性，在生理条件下，带正电荷的壳聚糖可与带负电荷的质粒通过静电作用，形成复合物。低分子质量壳聚糖（low molecular weight chitosan,LMWC）比高分子壳聚糖(high molecular weight chitosan，HMWC) 具有更加优良的载体性能[5]。我们采用亚硝酸钠法[6],从高分子质量壳聚糖制备了低分子质量壳聚糖。本研究探讨壳聚糖作为非病毒载体在体外和体内的转染效果，为其在基因治疗中的应用作了有益的探索。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    质粒IRES?eGFP和宿主菌E.coli Top10由本实验室保存，DMEM培养基，新生小牛血清为Hyclone公司产品，脂质体转染试剂盒（Lipofect AMINE）购自GIBCO公司，壳聚糖购自青岛海普生物技术有限公司，3T3细胞株来自NIH，小鼠为Balbc57/BL6由南京大学模式动物中心提供。荧光倒置显微镜为ZEISS公司的axioplan2，zeta电位仪为Brookhaven Instruments Corporation公司提供的90Plus Particle Size Analyzer。

    1.2  方法

    1.2.1  NaNO2法降解壳聚糖  称取2.5g壳聚糖，慢慢加入到250ml0.5%乙酸溶液中，保持室温搅拌，壳聚糖被浸润成棉絮状。称取75mgNaNO2，加入到壳聚糖溶液中，不断搅拌，溶液黏度明显下降。分别在30、60、90、120min后，取出50ml溶液，分别标记为A、B、C、D。使用zeta电位仪测定A、B、C、D4份样品的颗粒大小和zeta电位值，再使用乌式黏度计法测定相对分子质量，以备后用。

    1.2.2  细胞水平转染实验  使用壳聚糖，对细胞汇合度约70％的3T3细胞进行转染实验，同时制备脂质体/DNA复合物作为阳性对照，裸质粒DNA作为阴性对照，共同培养36h，通过流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达，定量检测转染效率。

    1.2.3  动物体内转染实验  取Balbc57/BL6小鼠24只，分为6组，每组4只，每组中1只为空白对照组，另外3只为实验组，由10μgGFP质粒(1μg·μl-1)、30μl PBS和20μg壳聚糖（1μg·μl-1）配成的复合物共60μl，孵育30min，用注射器注入小鼠股四头肌肉中，对照组注射10μgGFP质粒和20μlPBS的混合物，分别于注射1、2、3、4、5、6d后，对6组小鼠进行解剖，取大腿股四头肌注射部位进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察荧光表达强度。

    2  结    果

    2.1  NaNO2法降解壳聚糖

    4种壳聚糖物理特征见表1。表1  4种壳聚糖物理特征由表1可知，A壳聚糖平均粒径较小，通过细胞膜的通透性较好，分布比较集中，zeta电位也为正值，有利于与带负电荷的质粒结合，B、C壳聚糖粒径较大，且zeta电位为负，D壳聚糖虽然粒径小于A，但是多分散度差，即其中包含的有效小粒径比较少，因此，也不利于对于细胞的转染。后续的细胞转染结果也显示壳聚糖A的转染效率最好。

    对原料壳聚糖和A壳聚糖使用乌式黏度计法[7]测定其黏度，根据公式η＝κ（MV）α ，κ=6.589×10－3 ，α＝0.88，得到原料壳聚糖相对分子质量为46×107，降解30min后的壳聚糖相对分子质量为7.7×107，说明降解是有效的。

    2.2  细胞水平转染实验

    取降解时间为30min的壳聚糖，按质粒与壳聚糖质量比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5复合后对3T3细胞进行转染，结果如图1所示，可以发现，在两者质量比为1∶3时，转染效率最高。所以，按照最优比例1∶3，分别选用A、B、C、D壳聚糖进行转染实验，结果如图2所示，A壳聚糖转染效率最高。虽然它们的转染效率都低于阳性对照（脂质体）介导的转染，但是壳聚糖几乎无细胞毒性，这一点大大优于脂质体。因此，决定使用A壳聚糖，以质粒与壳聚糖质量比为1∶3的比例制备复合物，进行以下体内水平转染实验。

    2.3  动物水平转染实验

    分别在第1、2、3、4、5、6天对小鼠肌肉冰冻切片进行荧光观察。结果显示，只有在转染后第4天观察到有绿色荧光蛋白的表达，强度中等，而对照组则无明显的绿色荧光表达，同时发现第4天时，有的小鼠肌肉注射处有炎症反应，炎症反应处绿色荧光特别强烈。图1  流式细胞仪测得质粒与壳聚糖不同质量比的转染率

    3  讨    论

    本实验中，通过降解高分子质量壳聚糖，制备获得了一系列适用于转染的粒径大小[8]在200nm到500nm之间的壳聚糖。在细胞转染中，壳聚糖对3T3细胞具有一定的转染效率，尽管低于脂质体，但是由于其为天然产物，对细胞毒性低[9]，因此具有更好的应用前景。

    在动物水平，壳聚糖/质粒复合物体现出好于细胞水平的转染效率。这可能是由于：在细胞转染阶段，壳聚糖颗粒小，便于细胞对质粒/壳聚糖复合物的吞噬，以及该复合物易于从细胞溶酶体中逃逸[10]，从而有利于质粒表达。在体内转染中，存在一个复合物如何不被细胞间质和体液代谢掉的问题，与肿瘤中EPR效应相仿(即肿瘤组织所特有的高渗透性和高保留性)，颗粒较大的高分子质量壳聚糖比较容易积聚在注射部位，从而实现对注射部位肌肉纤维细胞的有效转染。因此，壳聚糖的分子质量并非越小越好，而是需要寻求细胞的吞噬和在注射部位停留时间之间的平衡。本实验中选用的颗粒大小为250nm的壳聚糖正好满足了以上的要求，为壳聚糖在体内肌肉细胞中的转染，提供了潜在的可行性,同时也为壳聚糖在炎症部位的定点给药提供了一种潜在的可能。

    壳聚糖作为基因载体的研究还不到20年，其与靶细胞的作用和转染机理目前尚不太清楚。近些年来，通过口服和滴注鼻腔等各种给药方式，壳聚糖及其衍生物对大分子药物进行有效的输送取得了良好的效果[11?12]，但是对壳聚糖及其衍生物在肌肉部位直接进行基因转染的报道甚少。本研究通过体内和体外实验证明，壳聚糖作为基因载体是一种潜在的、有效的、可直接应用于肌肉细胞转染的高分子材料，为基因治疗提供了一种新的手段。

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