VEGF?A及其受体VEGFR?1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨

来源:岁月联盟 作者:周怀君 时间:2010-07-12

【摘要】  目的:检测50例子宫内膜癌组织及癌旁正常内膜组织的VEGF?A和VEGFR?1的表达情况,探讨VEGF?A及其受体VEGFR?1是否与子宫内膜癌的侵袭与转移有关。方法: 采用RT?PCR技术对50例癌组织及癌旁正常组织进行VEGF?A和VEGFR?1 mRNA 半定量检测;采用Western blot进行其蛋白质表达的半定量检测。结果:癌组织VEGF?A 和VEGFR?1 mRNA表达水平及蛋白质水平均明显高于癌旁正常内膜组织;VEGF?A和VEGFR?1的高表达与子宫内膜癌肌层侵袭的深度有关,与淋巴结的转移无关;低分化癌组织VEGF?A的表达明显高于中、高分化,VEGFR?1的表达与细胞分化无关。结论: VEGF?A及其受体VEGFR?1的高表达可引起子宫内膜癌的肌层侵袭;癌分化越差,VEGF?A表达越高。

【关键词】  血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体 子宫内膜癌 侵袭与转移

    子宫内膜癌的侵袭与转移明显影响着病人的预后,而肿瘤血管的生成是肿瘤侵袭与转移所必须;研究表明,VEGF?A可诱导血管生成[1]。本研究就50例子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁正常内膜的VEGF?A及其受体VEGFR?1的表达进行检测,以探讨它与子宫内膜癌生物学行为的关系,现报道如下。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料 

    50例子宫内膜癌及癌旁正常内膜组织标本取自2004年3月至2006年12月间在南京大学医学院附属鼓楼的住院患者。年龄42~77岁,平均55岁。手术病理分期:Ⅰa 2例,Ⅰb 16例,Ⅰc 15例,Ⅱa 6例,Ⅱb 2例,Ⅲa 2例,Ⅲc 7例。子宫内膜腺癌组织学分级:G1 11例,G2 20例,G3 19例。

    1.2  标本采集

    子宫离体后立即纵行剖开,取癌组织约2 cm×1 cm大小,在癌组织基底部2 cm外侧取正常内膜约2 cm×1 cm大小。标本立即放入液氮罐中,-70 ℃冰箱中保存。

    1.3  采用逆转录聚合酶链反应(RT?PCR)检测mRNA的表达1.3.1  总RNA的提取与鉴定  每例标本取100 mg组织置于玻璃匀浆器中,采用Trizol一步法提取总RNA,样品经分光光度计检测吸光度A值,根据A值总RNA浓度,并行热稳定图像分析系统扫描各电泳带的灰度值,计算VEGF?A和VEGFR?1与β?actin的灰度值的比值,即为癌组织和癌旁正常内膜组织的mRNA表达水平。

    1.3.2  引物及试剂  设计的引物由上海生物工程公司合成。VEGF?A扩增的上游引物为5′?GCAGAAGGA

    GGAGGGCAGAATC?3′,下游引物为5′?ACACTCCAGG

    CCCTCGTCATT?3′,扩增片段长度为197 bp。VEGFR?1扩增的上游引物为5′?CAAGTGGC CAGAGGCATGG

    AGTT?3′,下游引物为5′?GATG TAGTCTTTACCATCC

    TGTTG?3′,扩增片段长度为498 bp。以β?actin为内参照,上游引物为5′?TT CCAGCCTTCCTTCCTGG?3′,下游引物为5′?TTGCGCT CAGGAGGAGCAAT?3′,扩增片段长度为224 bp。

    Trizol试剂、RNA酶抑制剂、M?MIV逆转录酶及Taq DNA聚合酶均购自上海生物工程公司。

    1.3.3   RT?PCR  逆转录反应体系为30 μl,RNA模板量为10 μg,采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA,在PTC?200PCR扩增仪上扩增。总反应体积为50 μl,每管加10 mmol·L-1 VEGF?A或VEGFR?1上下游引物各1 μl,10 mmol·L-1β?actin上下游引物各1 μl,10×PCR缓冲液5 μl,15 mol·L-1MgCl2 4 μl,TaqDNA酶0.4 μl,加水至50 μl。VEGF?A反应条件为:94 ℃变性1 min;56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30个循环;复性5 min。VEGFR?1反应条件为:94 ℃变性1 min;62 ℃退火2 min,72 ℃延伸3 min,35个循环;复性5 min。

    1.3.4  PCR产物测定  取10 μl PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳(120 V)30 min,在紫外灯下观察扩增的特异条带,凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值,计算VEGF?A和VEGFR?1与β?actin的灰度值的比值。

    1.4  Western blot检测蛋白质表达

    称取的组织标本0.5 g与500 μl的 RIPA组织裂解液加入玻璃匀浆器中,在冰中进行组织匀浆,4 ℃、12 000 g离心10 min,取其上清液,各标本取50 μl测蛋白浓度(Brandford法),调整各标本蛋白质量浓度为2 mg·L-1。取调整浓度后的组织细胞裂解液10 μl加入等体积2×电泳加样缓冲液,均匀后置95 ℃水中加热10 min。采用的分离胶浓度为12%,积层胶浓度为5%,在装置(Hoefer Pharmacia Biotech Inc,USA,型号为miniVE Complete,美国)上电泳,积层胶电压为80 V,分离胶电压为120 V;电泳结束后转膜,转膜装置(Bio?Rad公司,型号mini?protein Ⅱ cell,美国)设电压90 V、电流200 mA。转膜后的硝酸纤维素膜在封闭液中温和震荡1 h,再把膜放入1∶250的稀释一抗中,4 ℃过液,用TBST液洗膜3次,把膜置于1∶2 000稀释的二抗中温和震荡1 h,在TBST中洗膜3次,在暗室中膜上加入ECL液4 ml,曝光、显影、定影。图像分析系统扫描各X片条带的灰度值,计算VEGF?A和VEGFR?1与β?actin的灰度值的比值,即为癌组织和正常内膜组织的蛋白质表达水平。

    2  结    果

    2.1  子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜VEGF?A和VEGFR?1的表达    结果见表1和图1。

    2.2  子宫内膜癌VEGF?A和VEGFR?1的表达与组织病关系    结果见表2、3。癌旁及深肌层组VEGF?A在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组(P<0.05);G3明显高于G1、G2(P<0.05)。淋巴结转移组在mRNA及蛋白质的表达与淋巴结未转移组无显著差异(P>0.05)。宫旁及深肌层组VEGFR?1在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组(P<0.05;G3与G1、G2在mRNA及蛋白质的表达无差异(P>0.05)。淋巴结转移组在mRNA及蛋白质的表达与淋巴结未转移组无显著差异(P>0.05)。表1子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜

    3  讨    论

    3.1  VEGF?A及其受体VEGFR?1的分泌及作用机制

    VEGF?A是由肿瘤细胞及炎症浸润细胞所分泌[1]。它通过其受体VEGFR?1及VEGFR?2引起血管生成[2]。VEGFR?1在血管内皮细胞上表达,也可在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、外周细胞和胎盘的滋养细胞中表达[3]。Laxmanan等[4]研究发现VEGF?A可通过树突状细胞上的VEGFR?1改变树突状细胞的功能,从而使机体对肿瘤细胞的免疫抵抗力下降,肿瘤细胞易于转移和扩散。Yokoyama等[5]通过对86例子宫内膜癌组织进行免疫组化研究发现,VEGF?A及其受体在子宫内膜癌细胞浆表达。VEGFR?1和VEGFR?2在癌组织中也可在血管内皮细胞上表达。通过自分泌和旁分泌调节肿瘤血管的生成,促进肿瘤细胞的增殖。本研究结果显示,与癌旁正常子宫内膜组织相比,子宫内膜癌组织VEGF?A和VEGFR?1的表达明显增高;表明子宫内膜癌组织分泌VEGF?A和VEGFR?1。表2  子宫内膜癌VEGF?A的表达与手术病理分期的关系表3  子宫内膜癌VEGF?1的表达与手术病理分期的关系

    3.2  VEGF?A及其受体VEGFR?1在子宫内膜癌侵袭与转移的作用    本研究结果显示,癌组织VEGF?A和VEGFR?1的表达明显高于正常内膜组织,深肌层和宫颈宫旁侵袭时VEGF?A和VEGFR?1的表达明显高于浅肌层侵袭,但淋巴结转移患者VEGF?A和VEGFR?1的表达与未转移者无差异。Masatsugu认为,肿瘤的血管及淋巴管的生成是肿瘤的与转移所必需的。当肿瘤无血管形成时可持续几个月甚至几年不发生侵袭及转移;当从无生成血管的肿瘤细胞亚型变成生成血管的肿瘤细胞表型时,可促进肿瘤快速生长及转移。含有大量生成血管细胞的原发肿瘤可引起转移,使肿瘤在淋巴结及远处器官生长。即肿瘤细胞产生VEGFs越多,越易引起肿瘤侵袭与转移。Hirai等[6]研究认为,VEGF?A的表达与子宫内膜癌的血管侵袭有关,与淋巴管侵袭无关,与淋巴结转移有关。Soufla等[7]研究发现,VEGF?A在宫颈癌组织的表达明显高于CIN及正常宫颈组织,并与血管密度有关。  

    本研究表明,子宫内膜低分化及未分化癌细胞VEGF?A的表达明显高于高分化及中分化。这也可以解释分化差的癌组织易于深肌层侵袭及淋巴结转移。

    总之,VEGF?A的表达与内膜癌的侵袭明显相关,与淋巴结转移无关,可作为内膜癌病人预后的指标。

 

【】
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