抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定

【摘要】  目的：制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。方法：以RT?PCR扩增Trio的1 173 bp的基因片段并克隆入pET28a(＋) 和pGEX?4T?1 (His)6C表达载体中，表达并纯化Trio?His、Trio?GST融合蛋白。用纯化的Trio?His融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体，用Trio?GST亲和层析法进行纯化并采用Western blot法检测抗体生物学活性。结果：表达的Trio?His蛋白以包涵体的形式存在，用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的Trio?His融合蛋白，以纯化的Trio?His免疫家兔制备的兔抗Trio的抗体，经Western blot分析显示该抗体可与果蝇S2细胞Trio特异性结合。结论：获得具有良好特异性的兔抗Trio抗体，为进一步研究Trio的功能奠定了基础。

【关键词】  Trio基因 原核表达 抗体制备

    Trio基因是Dbl家族重要的一员，它编码的蛋白在人、小鼠、线虫、果蝇中具有高度的保守性。Trio能够活化Rho家族的GTPases，可能参与多种信号通路，已经发现它在轴突导向、神经细胞延伸和迁移中起着非常重要的作用，但该基因在果蝇中的功能尚不清楚 ［１］。本研究采用原核表达系统 ［２］制备并纯化了Trio?His融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得抗Trio抗体，为进一步研究Trio蛋白的功能奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存。质粒pET28a(＋)、pGEX?4T?1 (His)6C为Novagen公司产品；逆转录酶购自Promega公司，限制性内切酶、T4连接酶及高保真DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；小量胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；His亲和层析柱购自Clontech公司，CNBr活化的抗体纯化亲和层析柱Sepharose 4B为Amersham Pharmarcia公司产品；Western blot显影底物及BCA蛋白定量试剂盒均为Pierce公司产品,抗果蝇Tubulin抗体购自Sigma公司,HRP标记的羊抗兔IgG为Promega公司产品；雄性新西兰家兔体质量约2.5kg,购自本校实验动物中心。

    1.2  方法 ［3］

    1.2.1  目的基因的扩增  从野生型黑腹果蝇幼虫中提取总RNA，并逆转录为cDNA进行PCR扩增。上游引物的序列为 5′?GCGCGGATCCGCCAGCCCCGGCAAATGG?3′，下游引物的序列为5′?GCGCCTCGAGTTTGGTTGACAGGGGATTGG?3′（划线部分分别为BamHⅠ、Xho Ⅰ酶切位点）。PCR反应的参数为：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，53℃变性1 min，72 ℃延伸1 min，共34个循环;最后72 ℃延伸10 min。获得Trio 1 173 bp的基因片段。

    1.2.2  重组质粒的构建与鉴定  PCR产物分别经BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。割胶回收酶切片段，与经同样酶切的质粒pET28a(＋)和质粒pGEX?4T?1 (His)6C于16 ℃连接过夜。以连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含相应抗生素[质粒pET28a(＋)为卡那抗性,终质量浓度为25 mg·L-1；质粒pGEX?4T?1 (His)6C为氨苄抗性，终质量浓度为50 mg·L-1]的固体培养基上，于37 ℃过夜培养。挑阳性菌落，提取质粒，进行BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切和测序鉴定，得到重组质粒pET28a(＋)-Trio和pGEX?4T?1 (His)6C?Trio。

    1.2.3  目的蛋白的原核表达及纯化  将经酶切和测序鉴定的重组质粒pET28a(＋)?Trio和pGEX?4T?1 (His)6C?Trio分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，于37 ℃培养过夜。次日按1∶50接种至1 L含卡那霉素（终质量浓度为25 mg·L-1）的新鲜LB液体培养基中，于37 ℃振荡培养至细菌浓度的A600 nm约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，于37 ℃诱导表达3 h，离心收集菌体。菌体用1×PBS(pH 7.4)重悬，经超声裂解后，以10 000 r·min-1离心10 min收集上清和沉淀。经SDS?PAGE分析表明，表达的目的蛋白主要位于包涵体内。用缓冲液A(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 Tris?HCl，pH 8.0)溶解包涵体，取上清于Ni2+?NTA树脂层析柱中;用缓冲液B(8mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 Tris?HCl，pH 6.3)洗柱，直至A280 nm<0.01;用缓冲液C(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 Tris?HCl， pH 4.5)洗脱目的蛋白。收集的目的蛋白用SDS?PAGE进行分析。

    1.2.4  动物免疫及抗血清的制备 ［4］  将纯化的Trio?His融合蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行定量后免疫家兔2只，每只每次融和蛋白的用量为200 μg。初次免疫用完全弗氏佐剂乳化蛋白,皮下多点注射，2周后加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次,共加强免疫3次。经心脏取血,并分离血清，加0.2 g·L-1叠氮钠后于-70 ℃保存备用。

    1.2.5  抗体的纯化  将纯化的GST?Trio融合蛋白分别与CNBr活化的Sepherase 4B层析柱结合，制备亲和层析柱(按Sigma公司操作手册)。将免疫血清加于该层析柱中于4 ℃结合过夜。次日依次用1×PBS(pH7.4)、1×PBS(含2 mol·L-1 NaCl, pH 7.4)、1×PBS(pH 4.5)洗涤杂蛋白，最后用0.1 mol·L-1甘氨酸溶液(pH 2.8)进行洗脱。将洗脱液与1 mol·L-1 Tris?HCl(pH 9.5)溶液按20∶1的比例混合,加入1 g·L-1 NaN3,于4 ℃保存备用。

    1.2.6  抗Trio抗体特异性的Western blot分析  提取果蝇S2细胞中的总蛋白，煮沸5 min后，取10 μl进行SDS?PAGE(分离胶浓度为12.5%)分离（稳流250 mA电泳1.5 h）并转移至PVDF膜上。在含有200 ml·L-1 Tween?20的TBS(TBST)溶解的脱脂奶粉中封闭1 h，纯化的抗Trio抗体按1∶1 000稀释作为一抗（室温孵育1 h，TBST清洗8次）及带有HRP标记的羊抗兔的IgG（同上孵育及清洗,按产品说明书进行）。最后，加发光底物，于X光片上感光显色观察结果。用果蝇抗Tubulin抗体为对照（按产品说明书进行）。

    2  结    果

    2.1  重组载体的构建与鉴定

    用Trizol试剂从野生型黑腹果蝇W1118的幼虫中，提取总RNA，以紫外分光光度计测得A260 nm/A280 nm=1.92。经琼脂糖凝胶电泳显示，出现28S、18S及5S 3条带，说明RNA的纯度及完整性均符合要求。以果蝇幼虫总RNA的cDNA为模板，进行PCR扩增Trio的基因片段，用BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后，克隆到载体pET28a(＋) 和pGEX?4T?1 (His)6C中。提取阳性的重组质粒，用BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后得到1 173 bp的基因片段（图1）。经测序鉴定表明，阅读框架未变。得到重组质粒pET28a(＋)?Trio和pGEX?4T?1 (His)6C?Trio。

    A: 1. DNA相对分子质量标准（DL2000）；2. 重组质粒pET28a(＋)+Trio BamH Ⅰ/Xho Ⅰ 双切鉴定；3. DNA分子量标准（DL15000）。B: 1. DNA相对分子质量标准（DL2000）；  2. 重组质粒pGEX?Trio BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双切鉴定；3.DNA相对分子质量标准（DL15000）

    图1  重组质粒pET28a(＋)?Trio和pGEX?4T?1(His)6C?Trio酶切鉴定图

    Fig 1  Enzyme digestion of recombinant plasmids pET28a(＋)?Trio and pGEX?4T?1(His)6C?Trio2.2  Trio?His融合蛋白的表达及纯化

    重组表达质粒pET28a（+）?Trio 转化大肠杆菌BL21(DE3)后，在IPTG诱导下，稳定表达Trio?His融合蛋白。融合蛋白Trio ?His的相对分子质量（Mr）约为50 000,与理论值相一致（图2）。以该融合蛋白为抗原制备抗果蝇Trio的抗血清。

    1. 未经IPTG诱导细菌总蛋白; 2. 经IPTG诱导细菌的总蛋白; 3. 经IPTG诱导细菌的上清蛋白; 4. 经IPTG诱导细菌的沉淀蛋白; 5. 纯化后的Trio?His融合蛋白; 6. 标准相对分子质量蛋白

    图2  Trio?His融合蛋白原核诱导表达与纯化的SDS?PAGE电泳分析

    Fig 2  SDS?PAG analysis Trio?His protein为了下一步纯化抗体的需要，将重组质粒pGEX?Trio转至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导产生融合蛋白GST?Trio。通过Sepharose?4B glutathione亲和层析柱纯化获得GST?Trio融合蛋白，10％SDS?PAGE检测表达及纯化结果（图3）。GST?Trio大小约为70 000,与理论值一致。

    1. 空载质粒且未经IPTG诱导的细菌总蛋白；2. 空载质粒经IPTG诱导的细菌总蛋白(可见GST蛋白大小为28 000）; 3. 含Trio质粒未经IPTG诱导的细菌总蛋白; 4. 含Trio质粒经IPTG诱导的细菌总蛋白; 5. 含Trio质粒经IPTG诱导的细菌上清蛋白; 6. 含Trio质粒经IPTG诱导的细菌沉淀蛋白; 7.纯化后的GST?Trio融合蛋白; 8. 标准相对分子质量蛋白s

    3  讨    论

    Flybase中预测果蝇的Trio（CG18214）可能存在7种不同形式的mRNA，分别命名为CG18214?RA、CG18214?RB、CG18214?RC、CG18214?RD、CG18214?RE、CG18214?RF和CG18214?RG mRNA。相应地有7种不同形式的蛋白质,分别命名为CG18214?PA、CG18214?PB、CG18214?PC、CG18214?PD、CG18214?PE、CG18214?PF和CG18214?PG。我们采用原核表达系统诱导表达了Trio 7种形式共同区域的Trio?His融合蛋白，制备了抗Trio 7种形式的多克隆抗体，为进一步研究Trio的功能奠定基础。

    为便于纯化蛋白，我们将Trio亚克隆入含有高效的原核表达启动子的pET28a（＋）载体中。大肠杆菌中可高效表达带有组氨酸标签的重组蛋白，故可通过His亲和层析柱一步纯化得到Trio?His融合蛋白。该法最大的优点是，可通过尿素变性纯化存在于包涵体中的目的蛋白，节约了通过改变诱导条件使表达的蛋白以可溶状态存在于上清中的时间，可更加快速方便地纯化目的蛋白。用纯化的蛋白免疫家兔后，得到了抗Trio的抗体。为了下一步纯化抗体的需要，将重组质粒pGEX?4T?1 (His)6C+Trio转至大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导产生融合蛋白GST?Trio，通过Sepharose?4B glutathione亲和层析柱纯化获得GST?Trio融合蛋白，以该融合蛋白纯化免疫的兔血清，可以得到较纯的抗Trio抗体。Western blot的结果表明，该抗体具有较好的特异性，可作为研究Trio功能的工具。

【】
  ［1］BATEMAN J, VACTOR D V.The Trio family of guanine-nucleotide-exchange factors: regulators of axon guidance［J］.J Cell Sci,2001,114:1973?1980

［2］袁榴娣，张燕，万永奇,等.抗果蝇Dnop5蛋白抗体的制备及其特性鉴定［J］.细胞与分子免疫学杂志，2006，5（ 22 ）： 654?656.

［3］萨母布鲁克 J,弗里奇 E F, 曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南［M］.2版.北京：出版社,1999:43?355.

［4］徐云剑,苏力坦·阿巴白克力,吉栩，等.PPF1基因C端片段在大肠杆菌中的融合表达和纯化以及抗体的制备［J］.生物化学与分子生物学报,2002,18(5):594?599.