高效液相色谱法测定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有关物质的含量

【摘要】  目的： 建立高效液相色谱法测定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有关物质的含量。方法： 以汉邦Lichrospher C18 (200mm×4.6mm，5μm)为色谱柱,以甲醇-0.02mol·L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.2)(60∶40)为流动相,UV检测波长333nm,流速1.0ml·min-1。结果： 曲尼司特在25～200mg·L-l范围内具有良好线性关系 (r=0.999 9)，平均加样回收率为98.86%，RSD为1.10%；3批样品的标示百分含量(%)分别为99.57、100.17和99.87，有关物质的百分含量分别为0.52、0.56和0.55。结论：　本方法准确、灵敏、重现性好，可用于曲尼司特滴眼液及其有关物质的含量测定。

【关键词】  曲尼司特 滴眼剂 色谱法 高效液相 有关物质

   曲尼司特（tranilast，肉桂氨茴酸）为新的抗变态反应药物，可稳定肥大细胞和噬碱性细胞膜，阻止细胞裂解脱颗粒，从而抑制组胺、5?羟色胺、白三烯和SRS?A等过敏介质释放，目前，临床上主要用于过敏性哮喘、过敏性鼻炎和过敏性皮炎的与预防［1］。20世纪70年代首先由日本学者Koda等［2］研制成功；国内由药科大学研制成功，且仅有口服制剂的生产与销售，尚无其滴眼剂（治疗过敏性结膜炎），为此我们开发了曲尼司特滴眼液，为控制其质量，在［3］的基础上，建立了测定曲尼司特滴眼液含量及有关物质的高效液相色谱法。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  试药与试剂  曲尼司特对照品（纯度为100.5%，中国药科大学制药有限公司提供）；曲尼司特滴眼液（规格为5ml∶25mg，批号040512、040513和040514），甲醇色谱纯，磷酸二氢钾、无水乙醇为分析纯。

    1.1.2  仪器  高效液相色谱仪（Waters600E泵控系统，WatersTM 486紫外检测器，Rheodge7125进样器，HW色谱工作站）。

    1.2  色谱条件

    色谱柱：江苏汉邦Lichrospher C18 (200mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.02mol·L-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH值至4.2)(60∶40)，流速为1.0 ml·min-1,检测波长333nm，进样量为20μl。

    1.3  溶液的制备

    1.3.1   标准曲线的制备  精密称取曲尼司特对照品约25mg，置50ml棕色容量瓶中，加乙醇适量使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml分别置10ml棕色容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，制成系列浓度的标准溶液，分别进样20μl，记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

    1.3.2   含量测定溶液的制备  精密量取曲尼司特滴眼液2ml，置10ml棕色容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，再精密量取1ml，置10ml棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；精密称取曲尼司特对照品适量（约12.5mg），置25ml量瓶中，加乙醇适量使溶解，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml置25ml中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；取处方量辅料，用流动相配成不含主药的约相当于含曲尼司特0.1mg·ml-1的模拟处方溶液，振摇，过滤，取续滤液作为辅料供试溶液。

    1.3.3   方法学有关溶液的制备  精密量取5ml曲尼司特滴眼液5份，分别置25ml容量瓶或烧杯中，依次按下列步骤作破坏试验：（1）加入1mol·L-１盐酸溶液１ml，于室温下放置片刻，以１mol·L-1氢氧化钠溶液回调至中性。（2）加入１mol·L-1氢氧化钠溶液１ ml，于室温下放置片刻，以１mol·L-１盐酸回调至中性。（3）置于小烧杯中，电炉直接加热蒸干，冷却，加25ml流动相稀释溶解。（4）加流动相稀释至刻度，摇匀，于强光4500LX条件下放置4h。（5）加30%过氧化氢2ml于室温下放置片刻，分别用流动相稀释至刻度，滤过，取续滤液作为供试液；称取本品处方量辅料适量，分别经酸、碱、光、 热、氧化破坏后同上法操作，取续滤液20μl进样。

    1.3.4  有关物质试验溶液的制备  取“含量测定溶液的制备”项下贮备液作为供试品溶液，量取适量，加流动相制成每１ml含10μg的溶液作为预试溶液。

    1.4  分析测定

    1.4.1  含量测定  分别精密吸取对照品溶液与样品溶液20μl注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件，以外标法含量，测定3批样品的标示百分含量（%）。

    1.4.2  有关物质的测定  照色谱条件进行试验，取预试溶液20μl注入液相色谱仪进行预试，调整检测灵敏度，使主成分色谱峰高达满量程的20 %～25 %，再精密量取供试液20μl进样，记录色谱图主成分保留时间的2倍， 按峰面积归一化法计算降解产物的量。采用本法测定3批样品有关物质的标示百分含量 (%)。

    2  结    果

    2.1  色谱行为

    在试验确定条件下，空白辅料和有关物质对曲尼司特峰无干扰，且主峰分离较好，结果表明本色谱条件检测曲尼司特滴眼液的有关物质是可行的（分离度大于1.5）。见图1。A.空白辅料；B.对照品；C.有关物质(Ⅰ:曲尼司特)

    图1  曲尼司特色谱图

    2.2  方法可靠性

    在试验条件下，主药和辅料在酸、碱、热、光及氧化等破坏条件下，曲尼司特与有关破坏产物能有效分离，辅料和有关物质对其测定不产生干扰，从而证明该方法可靠。

    2.3  线性关系

    以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，回归得回归方程： A=17306.5c +44189.4，r=0.9999（n=5），结果表明本品在25～200mg·L-1浓度范围内与色谱峰面积线性良好。

    2.4  检测限

    在 0.002AU下时，以基线噪音3倍计算，本品的检测限为3ng（进样量20μl）。

    2.5  方法回收率及精密度测定

    取处方量辅料，加水制成处方浓度的空白溶液。按80%、100%、120%比例分别加入曲尼司特，加流动相稀释制成每1ml含曲尼司特分别为80、100和120μg的供试品溶液各3份，精密取20μl进样，计算回收率、日内相对标准偏差和日间相对标准偏差，结果见表1。表1  曲尼司特回收率及精密度

    2.6   辅料干扰试验

    取辅料供试溶液20μl，进样，记录色谱图，结果见图1。

    2.7  含量测定

    取含量供试溶液20μl，进样，记录色谱图，3批样品含量测定结果见表2。表2  含量测定结果  ％ 

    样品批号标示量RSD04051299.570.84040513100.170.8204051499.870.892.8  有关物质的含量测定

    采用上述色谱方法测定3批样品 (040512、040513和040514)，有关物质的含量 (%)分别为0.52、0.56和0.55。

    3  讨    论

    曲尼司特难溶于水，配制其对照溶液时先加入少量无水乙醇使之恰溶，然后加流动相定量，不干扰本品的含量测定及有关物质的检测。本品在光照条件下有关物质稍有增加，故我们在配制样品时应避光或使用棕色容量瓶，以减少降解。建立的HPLC法可实现曲尼司特与辅料及有关物质的有效分离，两者之间的分离度大于1.5，色谱柱效高。在流动相选择试验过程中发现pH值对试验有较大影响，当用磷酸调节pH值至4.2时，其色谱行为最佳，取得了较好分离效果。

    本品在25～200mg·L-1浓度范围内与色谱峰面积线性良好，含量测定回收率高且重现良好，可克服辅料及有关物质的干扰，具有准确、可靠、灵敏度高等特点，对控制本品及相关制剂的质量具有重要的意义。

【】
  ［1］陈新谦，金有豫，汤光. 新编药物学[M].15版. 北京：人民卫生出版社，2005： 416,562.

［2］KODA A，NAGAI H，WATANABE S，et al. Inhibition of hypersensivity reaction by a new drug,N?(3,4?dimethoxycinamoly) anthranitic acid (N?5)［J］. J Auergy Clin Immunol,1976,57:396?407.

［3］杞晓红，屠锡德.曲尼司特缓释胶囊剂及其药物动力学研究 ［J］.药科大学学报，1996,27（9）: 528?530.