RegⅣ基因在结直肠癌细胞系中的mRNA表达及pcDNA

                作者：高峰，郑声琴，张宇伟，金月玲，田小强，黄培林 

［摘要］

　　目的：探讨RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的表达水平，构建并转染pcDNARegⅣ重组质粒，为阐明RegⅣ基因在结直肠癌发生中的作用机制奠定基础。方法：采用RTPCR方法检测HT29、Caco2、Sw480、LoVo细胞系的RegⅣ基因表达水平，将获得目的基因RegⅣ克隆于pcDNA3.1/（-）质粒上，用PCR、酶切进行鉴定后，脂质体转染至低表达甚至不表达RegⅣ的结直癌细胞系，用G418筛选后进行RTPCR鉴定。结果：HT29、Caco2细胞系RegⅣ基因高表达，Sw480细胞系表达较前两者弱，LoVo细胞系RegⅣ阴性表达；构建的重组质粒中含有RegⅣ基因，经pcDNARegⅣ转染的LoVo细胞RegⅣ基因呈阳性表达。结论：RegⅣ基因在不同的结直肠癌细胞系中表达水平不同。成功构建和转染了pcDNARegⅣ,可使得RegⅣ（-）的LoVo细胞系RegⅣ基因呈阳性表达。

　　［关键词］RegⅣ基因；结直肠癌；重组质粒；基因表达；基因转染
 

　　Abstract：Objective  To  investigate the expression of RegⅣ in four colorectal cancer cells and construct recombinant plasmid pcDNARegⅣ and transfect it for further study of RegⅣ in colorectal cancer cells.Methods  RegⅣ obtained from colorectal cancer cells by RTPCR was cloned into pcDNA3.1/(-) to form pcDNARegⅣ which was transfected into colorectal cancer cell with less or no expression of RegⅣ via liposome after identification of PCR，restriction enzyme digesting and DNA sequencing. The colorectal cancer cells selected by G418 were identified by RTPCR.Results  There was a high expression of RegⅣ in HT29 and Caco2, less in Sw480，no expression in LoVo. The recombinant plasmid had RegⅣ gene which was expressed in RegⅣregative LoVo after transfection.Conclusions  The different expression levels of RegⅣ in four colorectal cancer cells are confirmed and the pcDNARegⅣ has been constructed and transfected successfully, which makes RegⅣ highly expressed in RegⅣregenerating LoVo cell.

　　Key words：regenerating gene Ⅳ; colorectal cancer; recombinant plasmid; gene expression; gene transfection  

　　RegⅣ是Reg家族中一个在结直肠腺瘤高表达的差异表达基因，它的高表达与腺瘤的形成、腺癌的发生有关［13］，并用反向Northern Blot得到证实［4］。尤其在癌前病变（腺瘤、溃疡性结肠炎［5］）、结直肠腺瘤癌变区的高表达提示，它可能是一个消化系统癌微转移的有效生物标记物。

　　目前RegⅣ基因在结直肠癌中的表达改变已逐渐被人们所关注，但RegⅣ在癌中的上调是一种癌发生的伴随现象还是一种肿瘤特异性的反应，或者只是组织损伤的敏感反应物还是在癌中起癌基因的作用等问题尚未阐明。本实验通过检测RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的mRNA表达水平，然后将高表达RegⅣ的cDNA目的基因构建成重组质粒pcDNARegⅣ，转染［67］至低表达甚至不表达RegⅣ的结直肠癌细胞系中，为阐明RegⅣ在癌发生中的作用机制提供一个有效可靠的方法。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　E.coli DH5α大肠杆菌为东南大学分子病理研究所保存；HT29、Sw480、Caco2、LoVo细胞系购自院上海生物化学与细胞生物学研究所； pcDNA3.1/（-）质粒、Trizol、Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品；DEPC购自南京凯基公司；Rnase、Marker Ⅳ购自南京天为时代公司；RTPCR试剂盒、EcoR1、BamH1、T4连接酶、PCR Purification Kit购自大连宝生物公司；100bpMark购自申能博彩公司；G418购自Gibco公司；无内毒素质粒中提试剂盒购自Promega公司。

　　1．2  方法

　　1．2．1  引物的设计与合成［6］
 
　　根据Genebank RegⅣ基因cds序列（全长477bp）和pcDNA3.1/(-)质粒特点，按照酶切位点对侧翼序列的要求设计引物并附带相应的酶切位点：上游引物，5′CATGGAATTCATGGCTTCCAGAAGCATGCGG3′；下游引物，5′CGCGGATCCCTATGGTCGGTACTTGCACAG3′。另外，设计一对片段长度为270bp的βactin基因引物：上游引物，5′ CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′；下游引物，5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′。

　　1．2．2  RegⅣ RTPCR扩增 

　　用Trizol提取4种结直肠癌细胞系的总RNA，然后进行逆转录合成cDNA，接着再按如下条件行PCR扩增：94℃ 2min;94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min， 30个循环;最后72℃ 7min。 1%琼脂糖电泳检测，然后用PCR Purification Kit纯化回收，定量备用。

　　1．2．3  pcDNARegⅣ载体的构建 

　　将纯化的RegⅣ片段（496bp，含酶切位点）和质粒pcDNA3.1/（-）(5.4kb)分别按如下反应体系进行双酶切反应：RegⅣ 12μl，pcDNA3.1/（-）12μl，10×Buffer 4μl，EcoR1 1.5μl, BamH1 1.5μl, ddH2O 21μl, 然后置37℃水浴2h，行琼脂糖电泳后分别用PCR Purification Kit纯化回收。

　　将酶切纯化回收后的RegⅣ片段和质粒pcDNA3.1/（-）分别按如下反应体系进行连接反应：10×Buffer 1μl，T4连接酶1μl，pcDNA3.1/（-）3μl，RegⅣ 5μl，16℃过夜，然后转化用CaCl2制备的新鲜感受态细菌DH5α。次日在含100μg・ml-1羧苄青的LB平板上挑取2个单菌落进行双酶切、PCR及采用PCR产物测序鉴定（ PCR产物需用回收胶试剂盒纯化）。

　　1．2．4  pcDNARegⅣ转染LoVo细胞系 

　　重组质粒pcDNARegⅣ 0.8μg置于50μl OptiMEM中，2μl Lipofectamine 2000置于50μl OptiMEM中，轻轻混匀，室温放置5min后合并为100μl，再轻轻混匀室温放置20min，加入24孔板培养的LoVo细胞系中24h，然后传代1次，加300μg・ml-1 G418筛选1周后行RTPCR；转染成功后改用100μg・ml-1 G418维持培养，细胞的靶基因RegⅣ可稳定表达。

　　2  结果

　　2．1  4种癌细胞系RegⅣ的RTPCR结果见图1。

　　1、2．HT29细胞；3.LoVo细胞；4.100bp　Mark；5.Caco2细胞； 6.Sw480细胞

　　图1  RegⅣ基因在4种结直肠癌细胞系中的表达水平（略）
　　Fig 1  The expression of RegⅣ in four colorectal cancer cells

　　2．2  重组质粒pcDNARegⅣ的双酶切鉴定结果见图2。

　　1、3.分别为两个重组质粒的EcoR1及BamH1双酶切；2.Mark Ⅳ(500bp、1kb、2kb、2.5kb、5.5kb、7kb)

　　图2  两个重组质粒的双酶切鉴定结果（略）
　　Fig 2  Identification of double enzyme digesting in two recombinant plasmids

　　2．3  重组质粒pcDNARegⅣ的PCR鉴定结果见图3。
 
　　1、2.分别为两个重组质粒的PCR结果；3.DL2000Mark

　　图3  两个重组质粒的PCR鉴定结果（略）
　　Fig 3  PCR identification of tworecombinant plasmids

　　2．4  PCR产物的测序

　　PCR产物采用下游引物进行反向测序，结果如下：　GTTGGCGCTTGTTGCATTCGTTGCTGCTCCAAGTTAAAAAGTTGTTATTGGAGCTCATCTCAGCACAGTGCTTGTTCCCACCCATGGACTTGCCAGACCAGGATCTGTACAGATACATGGCCCCATCAATCCACTGCCACTGCTGCCTCTTCTGTGGGTCGTGCAGGCCAATCCATATCGGCT
GGCTTCTCTGATAGCCACTTATGTACTCTGCTATGGTGCTGGCTTCCTTTAAACTCAGGATAGATGCCAGGTGGGCTCCGTTTCCGTAAGACTGACACTCGAGCTCGGCATCAGACCAGTTCCTCAGCTTCCTGAAGTAACCATAGCAATTGGACTTGTGGTAAAACCATCCAGGAGCACAGCTGG
GTCTCATGATGATATCACCCAGGACTCCTGTTTTGGCCAGGCAGCTCAGCAATAGGAGCAGCCGCATGCTTCTGGAAGCCATGAATTCCATG。

　　2．5  重组质粒pcDNA

　　RegⅣ转染LoVo细胞后的RTPCR结果    见图4。

　　1.100bp Mark; 2.pcDNARegⅣ 转染的LoVo细胞;3.pcDNA3.1/（-）转染的LoVo细胞; 4.LoVo 细胞

　　图4  转染LoVo细胞后的RTPCR结果（略）
　　Fig 4  RTPCR identification of transfected LoVo cell

　　3  讨论

　　Reg 家族的第一个成员被发现已有15年。证实Reg基因家族与肝、胰、胃、肠细胞的增殖分化以及糖尿病、炎症、创伤、消化系统肿瘤有关，亦有文献报道它可能与微卫星不稳定性、细胞凋亡、肿瘤的发生及癌症的不良预后有关。Zhang 等［2］1999年通过抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization，SSH)在1例同时患有结肠腺瘤及结肠腺癌病例的正常结肠黏膜、腺瘤及腺癌建立了3个差减文库，研究结果显示RegⅣ的高表达与腺瘤的形成、腺癌的发生有关。获得的差异表达基因RegⅣ是已发现的Reg家族17个成员中的1个。2001年Hartupee等［8］报道RegⅣ位于1号染色体长臂，其不仅基因序列与先前研究较多的RegⅠ部分同源，结构也有相似之处，在结直肠癌表达的上调率也与RegⅠ相近。到目前为止，国内外关于RegⅣ的研究文献鲜见。在本实验中，我们对4种结直肠癌细胞系（HT29、Caco-2、Sw480、LoVo细胞系）的RegⅣ基因表达水平进行了检测，结果显示HT29、Caco-2细胞系RegⅣ基因高表达，Sw480细胞系表达较前两者弱，LoVo细胞系RegⅣ阴性表达，与Violette等［9］的报道不一致。我们分析其原因可能与各个实验室的实验条件和实验方法有关，为此我们构建了重组质粒pcDNARegⅣ，并对RegⅣ（-）LoVo细胞系进行了基因转染，以观察转染前后RegⅣ mRNA表达的改变。结果表明RegⅣ（-）LoVo细胞经pcDNARegⅣ转染后，RegⅣ（-）LoVo细胞系呈现RegⅣmRNA高表达，从而验证了上述结果。

　　常用的基因转染技术是利用一定的载体和导入方法将外源基因或靶基因导入靶细胞，并使其在靶细胞内表达。转染方法有多种，根据细胞的不同，贴壁或悬浮细胞可选用不同的方法，其目的是要提高转染效率。我们选用的是脂质体转染，它具有高效、快速、方便易行的特点，可对各种类型的细胞达到较高的转染效率。本实验通过构建含目的基因RegⅣ的重组质粒载体转入低表达或表达缺失的细胞系，观察转染后细胞RegⅣ的表达水平。我们构建的重组质粒载体经过PCR、酶切鉴定和测序，结果与Genebank RegⅣ基因进行了比对，证实为RegⅣ基因序列；RTPCR检测结果表明，经转染的LoVo癌细胞能够高表达RegⅣ mRNA。Reg Ⅳ 在结直肠癌发生发展中的作用及其机制至今研究甚少，有必要利用基因转染技术，深入研究和阐明RegⅣ基因在Reg家族中充当的角色及其功能 ［10］。

　　［文献］

　　［1］ZHANG Y W, LAI M D, GU X M, et al. Reg Ⅳ, a differentially expressed gene in colorectal adenoma［J］. Chin Med J, 2003,116（6）：918922.

　　［2］ZHANG Y W, LAI M D, LV B J, et al. Overexpression of Reg Ⅳ in colorectal adenoma［J］. Cancer Letters， 2003,200（1）：6976.

　　［3］ZHANG Y W, DING L S, LAI M D. Reg gene family and human diseases［J］. World  J  Gastroenterol， 2003,9（12）：26352641.

　　［4］张宇伟，来茂德. 非同位素反向Northern筛选法［J］. 遗传,2004,26（3）：353355.

　　［5］KAMARAINEN M, HEISKALA K, KNUUTILA S, et al. RELP, a novel human reglike protein with upregulated expression in inflammatory and metaplastic gastrointestinal mucosa［J］. Am J Pathol, 2003,163（1）：1120.

　　［6］洪晓武，窦骏，陈国兵，等. mGMCSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定［J］. 实用癌症杂志,2004,19（1）：912.

　　［7］WU G, NOMOTO S, HOQUE M O, et al. Delta Np63 alpha and TAp63 alpha regulate transcription of genes with distinct biological functions in cancer and development［J］. Cancer Res, 2003,63（10）：23512357.

　　［8］HARTUPEE J C, ZHANG H, BONALDO M F, et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a novel member of the human regenerating protein family: Reg Ⅳ［J］. Biochim Biophys Acta, 2001,1518（3）：287293.

　　［9］VIOLETTE S, FESTOR E, PANDREAVASILE I， et al. Reg Ⅳ, a new member of the regenerating gene family, is overexpressed in colorectal carcinomas［J］. Int J Cancer, 2003,103（2）：185193.

　　［10］LI A, CRIMMINS D L, LUO Q, et al. Expression of a novel regenerating gene product, Reg Ⅳ, by high density fermentation in Pichia pastoris: production, purification and characterization［J］. Protein Expr Purif, 2003,31（2）：197206.