微波法与高温高压法抗原修复的探讨

【摘要】  　　目的：探讨微波法与高温高压法对抗原修复的效果。方法：分别应用微波辐射法、高压锅直接煮沸法进行抗原修复，行免疫组化染色并比较其应用效果。结果：微波修复背景较清晰，阳性细胞表达在应该出现的标本切片中可以见到但表达不明显。使用高压锅修复，这样修复的效果是背景干净清晰而且阳性信号强。结论：高温高压法较微波法切片背景干净,显色对比鲜明，结构清晰，定位准确，易于观察，方法稳定，结果可靠，可提高病理诊断的准确性。

【关键词】  抗原　修复　免疫组织化学

　　免疫组织化学染色技术以其操作简单，敏感性高，特异性强，能将形态和抗原定位结合起来等优点广泛应用于肿瘤临床病理诊断和鉴别诊断［１］。因此免疫组织化学染色结果的可靠性受到了极大的关注，目前操作中最突出的问题是抗原修复的问题，我们对常用的抗体比较了微波炉加热和压力锅高温高压两种修复方法，先将结果如下。

    1  材料与方法

    1.1  仪器

    市售家用压力锅，工作压力为90 kPa，惠而浦微波炉。

    1.2  试剂

    ER、PR、C-erbB-2 试剂为北京中杉金桥生物技术有限公司生产的试剂，加热修复液为枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)。

    1.3  材料

    收集本院乳腺癌患者标本20例，10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片3 μm～4 μm。每例均切6张，附贴于涂有多聚－L－赖氨酸的玻片上，置60 ℃烤箱内烘烤。分别用于微波辐射法与高压锅直接煮沸法进行抗原修复，然后进行免疫组化染色。

    1.4  方法

    微波辐射法：石蜡切片脱蜡至水。PBS浸泡2 min×3次，先将修复液烧开，温度为95 ℃～100 ℃然后将切片放入修复液中，加热3 min，此时降低火力持续15 min～20 min。然后冷却。→3%H2O2室温孵育5 min～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性→蒸馏水冲洗→PBS浸泡2 min×3次→滴加一抗工作液，37 ℃孵育1 h～2 h或4 ℃过夜→PBS冲洗2 min×3次→滴加适当量的二抗，37 ℃孵育 0.5 h→PBS冲洗2 min×3次→显色剂显色（DAB）→自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

    高压锅直接煮沸法：石蜡切片脱蜡至水。PBS浸泡2 min×3次将修复液烧开后将切片放入高压锅中，然后盖好盖子，加上气压阀，继续加热至喷汽时,即达到工作温度和工作压力,开始计时2 min后压力锅离开热源，自然冷却。余同微波辐射法。

    免疫组化阳性标准判定：阳性细胞为棕黄色，ER、PR阳性颗粒定位于细胞核，C-erbB-2阳性颗粒定位于细胞膜。阳性对照选择预试验阳性切片，阴性对照用PBS代替一抗。

    2  结果

    20例乳腺癌切片经微波修复者，ER、PR 10例呈阳性表达，阳性率为50%，呈强阳性表达者仅3例（15%）。C-erbB-2  8例呈阳性表达，阳性率为40%，均呈弱阳性表达。背景较清晰，阳性细胞表达在应该出现的标本切片中可以见到但表达不明显，即阳性强度弱，阳性细胞数少。而使用高压锅煮沸法ER、PR 16例呈阳性表达，表达阳性率80%，呈强阳性表达12（60%）。C-erbB-2 10例呈阳性表达，阳性率为50%，均呈强阳性表达。高压锅煮沸法背景更干净、清晰，阳性信号强、表达细胞数量也较多。

    3  讨论

    免疫组织化学技术是免疫学与分子生物学技术和病理形态结合的一门新兴学科。它是一种用已知抗体或抗原检测组织细胞中的抗原或抗体的技术，具有操作简单、敏感性高、特异性强及将形态、代谢和机能密切集合起来等优点，已广泛用于病理诊断、鉴别诊断。乳腺癌ER、PR、C-erbB-2的检测可用于指导临床用药及判断预后。但经10%福尔马林固定石蜡包埋的切片，组织中的许多抗原决定簇被醛基交联封闭，以至于无法和抗体结合，从而影响染色结果［2］。因此组织中抗原性修复技术与免疫组织化学染色的成败有十分密切的关系。我们应用微波辐射法和高压锅直接煮沸法对20例乳腺癌组织切片分别进行抗原修复，以观察其对乳腺癌ER、PR、C-erbB-2染色效果的影响。我们的体会如下。

    抗原热修复的原因和理论基础是通过加热水解被醛基交联封闭的许多抗原决定簇，使抗原决定簇被激活。抗原修复的有效性是指加热温度（T）×　加热时间（t）。所以修复的温度和修复的时间非常重要。用微波炉做抗原修复，使用方便但温度不易掌握，很容易受外界因素的影响：比如修复液的起始温度不同时要适当改变预热的时间；微波炉使用一定时间后，即使相同的加热时间也可能会出现温度不同；修复液的量不同加热所需要的时间也不同；预热后维持的时间不够也会使抗原暴露不充分等等。用微波炉做抗原修复还要注意预热的温度，一定要达到95 ℃～100 ℃，并且要在预热温度的基础上维持15 min～20 min，这样才能达到使抗原决定簇完全暴露的目的。另外缓冲液沸腾可导致脱片，且金属仪器均不能使用，有一定的局限性。如果选用高压锅修复就可以避免因为外界环境改变所导致的对温度的影响，因此高压抗原修复法在染色强度和重复性等方面优于微波法［3］。报道，纪小龙等［4］曾对43种抗体进行了微波辐射和高压加热对比观察，结果发现，17种抗体经高压方法处理后，染色效果明显增强，与我们的实验结果相同。因高压抗原修复法不必改变修复预热条件，只要高压锅喷气2 min～2.5 min的状态下那么温度就在120 ℃，所以不必去测量温度，也不用改变操作条件，既有操作方便、省时间、受热均匀的优点，又可以取得理想的染色效果，十分可取。并且切片背景干净，显色对比鲜明， 结构清晰，定位准确，易于观察，方法稳定，结果可靠。

【文献】
  　　［１］ 熊正文，王伯云，李春光，等.提高免疫细胞化学染色的新技术研究及应用.医学研究通讯，2002，30（2）：36～38.

［2］ 倪灿荣.病技术［Ｍ］.第１版.北京：人民卫生出版社,2000：366～368.

［3］ 梁晓俐.病理学基础与实验技术.北京:军事医学出版社,2003：195～197.

［4］ 纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学.北京：军事医学出版社，1997：14～16.