细胞悬液法与组织块埋植法制作兔VX2肝癌影像模型的对照研究

                    作者：郭兴 丁伟 李雪鹏 宋惠坤  

【摘要】  　　目的：通过对照细胞悬液法与组织块埋植法，选择较合理的兔VX2肝癌模型的造模方法。方法：取传代荷瘤VX2种兔，分离肿瘤，制备肿瘤细胞悬液和肿瘤组织块，取新西兰大白兔各10只，分别经超声导引肝内注射和开腹肝内组织块埋植，3周后处死模型兔，观察原位肿瘤大小，肝内、腹腔及肺部转移情况。结果：两种方法造模，成模率均为100％；组织块埋植法组原位肿瘤体积明显大于细胞悬液组；组织块埋植造模较少引起异位种植，肿瘤生长较为均一。结论：组织块埋植法优于细胞悬液法。

【关键词】  VX2 肝癌 动物模型

　　Abstract  Objective:To choose a better method to make a rabbit VX2 liver cancer model through cell suspension injecting and tissue lump embedding. Methods： After separating the tumors in cancer bearing VX2 rabbit, cells suspension and tissue lump were prepared. Then the cells suspension was injected into ten New -Zealand albino rabbits livers through hypersound .And tissue lumps were embedded into another ten New -Zealand albino rabbits livers .After 3 weeks, model rabbits were executed ,the size of tumors ,intra-liver, enterocoelia, bellows transfer were recorded. Results： The achievement ratio of VX2 model was 100% for these two methods. The size of tumor in tissue lump embedding group was significantly larger than cell suspension injecting group. Ectopia plant was much less in tissue lump embedding group, and the tumors were uniform. Conclusion： The method of tissue lump embedding was better than cell suspension injecting.
   
　　Key words  VX2；Liver cancer；Rabbit model

　　VX2肿瘤细胞株是由shope病毒诱发兔乳头状瘤衍生的鳞状细胞癌，经过移植传72代后正式建株、命名［１，２］。由于兔缺乏对VX2细胞的免疫，可直接移植至肝、肾、肌肉等器官建立原位模型［３］，是目前较常使用的医学影像模型。报道VX2肝癌模型的制作方法主要包括细胞悬液法和组织块埋植法，本研究通过两种造模方法对照，以探讨较为简便实用，成模率高的模型制作方法。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料
         
　　新西兰大白兔40只，2 kg～2.2 kg，雌雄各半，四川大学实验动物中心提供, 合格证号：10）荷瘤VX2种兔 (由华中科技大学介入科冯敢生教授惠赠)，超声诊断仪（惠普HDI 5000，美国），CO2孵箱(SANYO, MCO-17A2,日本)，倒置显微镜（OLYMPUS, 日本），血细胞计数板，DMEM培养液（自制），PBS缓冲液（自制），显微手术器械。

　　1.2  方法

　　1.2.1  细胞悬液及肿瘤组织块制备：取传代中大腿荷瘤种兔一只，提前一天大腿内侧备皮，腹腔内注射10％水合氯醛2.5 mL/kg，安定2.5 mg/kg，麻醉后，碘伏大腿内侧及腹股沟区消毒，剪开局部皮肤，分离皮下组织，细心分离肿瘤，将肿瘤完整取出。剪开肿瘤，置于37 ℃PBS缓冲液的培养皿中，用解剖镊细心分离肿瘤组织，将血管及坏死组织分离清除干净，置于盛DMEM培养液的培养皿中，取鱼肉样肿瘤组织分别制备细胞悬液和组织块：用眼科剪剪碎成约1 mm３大小， 2 mL匀浆器匀浆，制备细胞悬液，血细胞计数板计数，DMEM培养液调整细胞浓度，达到>107 cell/mL；将肿瘤组织剪成约4 mm×4 mm×4 mm大小组织块，置DMEM培养液中。细胞悬液及组织块制备完成后，放入5％CO2孵箱待用。以上操作在超净工作台完成，保证无菌。

　　1.2.2  肿瘤肝内接种：健康2 kg～2.2 kg新西兰大白兔20只，随机数字表法随机分为组织块组和细胞悬液组，分别采取如下方法行肿瘤接种，组织块组：兔上腹部提前一天备皮，麻醉后固定于兔台，消毒上腹部皮肤、铺无菌单，剑突下3 cm纵行切开约2 cm～3 cm切口，暴露肝脏，用手术刀柄将肝左外叶轻轻挑出，使用1号丝线穿过肝脏，慢慢将肝脏拉出切口，无菌纱布保护切口，在肝左外叶有肝左中叶覆盖部分用眼科剪剪约0.5 cm的小口，用解剖镊伸入切口沿肝脏走行方向造成深约1 cm的隧道，镊取已经准备好的4 mm×4 mm×4 mm 的肿瘤组织塞入隧道内，剪取一小块明胶海绵填堵切口。抽出一号丝线，将肝脏慢慢送入腹腔后关腹;细胞悬液组：动物术前准备同前组，固定、麻醉完成后，置于超声检查床，抽取细胞悬液0.2 mL，超声导引下经皮穿刺，将细胞悬液注入肝左外叶。接种完成后连续3 d肌注青霉素5万 U/kg，庆大霉素2.5 mg/kg(或0.25万U/kg)。

　　1.2.3  成瘤观察：按以上两种方法接种完成后，送动物室饲养3周，按肿瘤接种麻醉方法麻醉荷瘤兔，触摸心脏波动最强烈部位，用10 mL注射器心脏穿刺，注射空气，处死。剖腹，观察腹腔内肝外脏器、腹腔（包括壁层腹膜及网膜）及腹壁有无肿瘤种植，并记录。分离肝脏将肝脏完整取出，观察肝脏表面肿瘤原种植部位肿瘤大小，分离出肿瘤，使用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)及短径(b)，按以下公式肿瘤体积（V）：V (cm3) =πab2/6。同时观察肝脏表面其他部位有无转移病灶。

　　1.2.4  统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件，描述性统计分析，肿瘤大小比较符合参数检验条件，两组数据比较采用t检验，肿瘤成模率及异位转移比较采用Fisher’s确切概率法检验。

　　2  结果
         
　　组织块接种组肿瘤体积明显大于细胞悬液接种组，差异有统计学意义，且前者极差及变异系数明显小于后者，统计结果见表1；除组织块组其中一只因腹泻死亡，两组存活动物肝内均有肿瘤生长；组织块组和细胞悬液组发生腹腔、肝内和肺内转移的比例分别：22％、33％、0％和80％、100％、20％，组织块组较少发生异位种植，两组间差异有统计学意义，统计结果见表2。

　　表1  不同方法制作的VX2肝癌模型原位肿瘤大小（略）

　　* 与细胞悬液组对照差异有统计学意义 P=0.002

　　表2  不同方法造模VX2肝癌异位种植情况（略）

　　*与组织块组对照差异有统计学意义P=0.017；**与组织块组对照差异有统计学意义P=0.000。

　　3  讨论
           
　　VX2肝癌肿瘤模型是目前唯一的可接种的中等动物模型［２，３］。由于VX2肿瘤细胞恶性度极高，侵袭性强，极易发生肿瘤的转移，不能作为生存率评价的动物模型［４］。目前VX2肝癌模型常作为影像学诊断的评价，也作为肝癌介入评价的动物模型。但是肿瘤的大小直接依赖于接种细胞和肿瘤组织的量，肿瘤细胞和肿瘤组织的植入方法将直接影响成模肿瘤的大小。目前报道VX2肝癌模型的制作方法主要包括肝内细胞悬液注射和肝内组织块填埋，肿瘤细胞和肿瘤组织的植入途径包括开腹肝内细胞悬液注射、CT或超声导引下经皮肝穿刺肝内注射、开腹肝内组织块填埋。王晓东等［５］对VX2活细胞数与肝癌模型成瘤率及成模时间的关系进行了研究，指出细胞数>1×105成模率达到90％～100％，成模时间与接种细胞数相关，接种细胞数越多成模时间越短。较多学者认为细胞悬液直接注射接种方便可靠，成模率高。褚朝顺等［４］认为肝内组织块植入，生物胶封口可以提高成模率，减少肝外转移。
         
　　本试验对经皮肝穿刺肿瘤细胞悬液注射和开腹肝内埋植不同组织块对肿瘤成模的影响进行考察。细胞悬液使用常规使用浓度107 cell/mL。在预实验中对0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL不同的注射剂量进行了初步观察，发现只要细胞浓度大于107 cell/mL，不同注射体积成模均为100％，也证明了王晓东等得出的植入细胞数大于105，成模率90%～100％的结论。同时观察到随注射体积的增大，肝内及肝外转移将增加，不能形成较为孤立的肿瘤，所以采用较小体积0.2 mL。文献设计，在行组织块埋植时选用约4 mm×4 mm×4 mm组织块。由于肿瘤的成模时间决定于植入的活细胞数，综合实验等待时间和肿瘤细胞、组织的植入的可操作性，将对肿瘤的观察时间确定为3周。除组织块组一只动物在第6 d因腹泻死亡外，其他动物均成活，并且均有肿瘤生长，各组间不存在造模成功率的差异。这一结果验证了VX2成模快、成模率高的特点，只要接种细胞数量足够，成模率100％。细胞悬液组10只全部出现肝内转移，其中有8只出现腹腔转移，并有2例出现了双肺转移，而组织块组出现较少的腹腔转移和肝内转移，两组间差异具有统计学意义。造成细胞悬液肝内注射接种腹腔和肝内转移较多的原因，可能由于穿刺针穿刺进入肝脏之后，细胞悬液注射过程中，较多的肿瘤细胞可能进入肝血窦，进入血窦的肿瘤细胞可能进入肝静脉回流至下腔静脉进入肺动脉，在肺内发生转移，同时肿瘤细胞可能借注射器的压力沿肝脏Glisson系统在肝内转移［４］。造成细胞悬液接种腹腔转移的原因可能为在注射过程中，部分细胞通过穿刺针孔反流，落入腹腔造成在腹腔内种植。而单个组织块器械夹持方便，对周围腹腔脏器的保护较为容易，造成肝内和肺转移的可能性减少，同时注意保护周围脏器，一般不会造成腹腔种植转移，因此组织块埋植造模原位肿瘤单发成模率高同时可减少异位种植和转移。
         
　　两组肿瘤体积具有较大的差异，组织块组肿瘤明显大于细胞悬液组，差异有统计学意义，其原因可能是植入的细胞悬液可能借助注射器压力，沿肝脏Glisson系统和组织间隙向周围扩散，不能聚集于局部，同时细胞悬液经稀释后细胞数较少。组织块组肿瘤体积的变异系数小于细胞悬液组，说明细胞悬液组肿瘤生长的均一性较差，如作为影像模型使用，差异较大的肿瘤边界特征和肿瘤血管成熟程度以及血管密度差异可能会较大，造成模型的基线标准的不一致。因此组织块埋植法造模，可以改善肿瘤生长的均一性。
         
　　本实验通过对照细胞悬液法和组织块埋植法制作VX2肝癌模型，组织块埋植法制作的肿瘤模型，具有肿瘤生长较为均一，转移少，肿瘤大小较好控制的特点。同时操作较为简便，具备一般的外常识即能完成造模，熟练后，整个操作在5 min内可完成。而细胞悬液法制作模型，虽不需外科操作，但需借助CT或超声导引，造模成本增高，同时成模肿瘤生长不一致，具有较高的转移率。因此组织块埋植法制作兔VX2肝癌模型优于细胞悬液法。

【参考文献】
  　　［１］ Swistel AL, Bading JR, Raaf JH, et al. Intra-arterial versus in-travenous adriamycin in the rabbit VX2 tumor system. Cancer, 1984,53:1　397～1　404.

　　［２］ Kuszyk BS，Boitontt JK，Chotl MA，et al．Locall tumor recurrence following hepatic cryoablation(radiologlc-histopathologic correlation in a rabbit model).Radiology,2000, 217:477～486.

　　［３］ Yi Miao,Yicheng Ni,Hilde Bosmans,et al．Radiofrequency ablation for eradication of pulmonary tumor in rabbits. Surg Res，200１,99:265～271.

　　［４］ 褚朝顺,苗 毅,奚春华，等.兔局限性肝癌模型的建立．肝胆外科杂志，2004,12:381.

　　［５］ 王晓东,任 军,杨仁杰，等.VX2活细胞数与兔肝癌模型成功率及成瘤时问的关系.肿瘤医学，2005,13:589～591.