电鳐乙酰胆碱受体诱导转基因小鼠重症肌无力的机制

            作者：金桂花　李红花 ，孟繁平 ，李英信 ，李芳芳 ，孙昌元 金权鑫

【关键词】  ,,重症肌无力;受体,胆碱能;小鼠,转基因

       ［摘要］ ［目的］ 探讨电鳐乙酰胆碱受体诱导人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的机制. ［方法］ 将电鳐电器官分离并纯化的乙酰胆碱受体作为免疫原，免疫人免疫球蛋白转基因小鼠，以放射免疫方法测定小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度，以免疫荧光技术观察小鼠骨骼肌中抗乙酰胆碱受体抗体的结合性. ［结果］ 小鼠血清中的抗乙酰胆碱受体抗体滴度为155～539pmol，小鼠肌肉中具有人抗乙酰胆碱受体抗体. ［结论］ 电鳐乙酰胆碱受体刺激人免疫球蛋白转基因小鼠产生的人抗乙酰胆碱受体抗体，可与肌肉组织中的乙酰胆碱受体结合，导致肌肉收缩无力，可诱导重症肌无力.

　　［关键词］  重症肌无力;受体，胆碱能;小鼠，转基因

    ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the pathogenesis of experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG），induced with Torpedo acetylcholine receptor（AChR），in mice transgenic for human immunoglobulin（Ig）loci.METHODS Mice transgenic for human Ig loci were immunized with Torpedo AChR，isolated and purified from electronic organs of Torpedo.The titers of anti-mouse AChR antibody in the sera of mice were determined by radioimmunoassay.The binding of human anti-AChR antibodies to the AChR in the muscle of mice was measured by immunofluorescence technique.RESULTS The titers of anti-mouse AChR antibodies in the sera ranged from155to539pmol.The human anti-AChR antibodies were found to bind to the muscle section.CONCLUSION The human anti-AChR antibodies，secreted from the mice transgenic for human Ig loci，induced with Torpedo AChR，are able to bind to AChR in the mouse muscles，which leads to the damages  of AChR，resulting in the animal EAMG.

    Key words:myasthenia gravis;receptors，cholinergic;mice，transgenic

    抗乙酰胆碱受体抗体与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体结合，可激活补体而使突触后膜乙酰胆碱受体遭到破坏，导致肌肉收缩无力，出现重症肌无力症状.引起重症肌无力的病因目前尚不清楚，但若给动物免疫乙酰胆碱受体或注射抗乙酰胆碱受体抗体，可引发实验性自身免疫性重症肌无力 ［1，2］ .在以乙酰胆碱受体作为免疫原建立重症肌无力动物模型中，常用由电鳐电器官制备的乙酰胆碱受体，是因为电鳐的乙酰胆碱受体含量及与哺乳类动物骨骼肌乙酰胆碱受体的同源性均较高 ［3］ .电鳐乙酰胆碱受体刺激动物产生的抗电鳐乙酰胆碱受体抗体可与动物本身骨骼肌的乙酰胆碱受体进行交叉反应.本实验室曾报道了以电鳐乙酰胆碱受体免疫人免疫球蛋白转基因小鼠建立重症肌无力动物模型 ［4］ ，其中发现实验动物出现重症肌无力的关键症状，即肌肉收缩无力，血清中亦检测到了抗电鳐乙酰胆碱受体抗体.本文探讨了电鳐乙酰胆碱受体诱导人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的机制.

    1 材料与方法

    1.1 材料  含人免疫球蛋白μ，γ1，κ胚系基因的转基因小鼠由荷兰马斯特里赫特大学医学院神经学系神经免疫学实验室根据［5，6］介绍的方法建立.电鳐乙酰胆碱受体由本实验室从电鳐电器官（Pacific Biomarine，California，USA）中分离，并经眼镜蛇毒素亲和层析纯化获得 ［7］ ; 125 I-α-银环蛇毒素为英国Amersham Pharmacia Biotech公司产品;小鼠乙酰胆碱受体粗提液由本实验室从小鼠骨骼肌中提取;羊抗人免疫球蛋白血清为本实验室自制;羊抗人免疫球蛋白G购自美国Cappel，ICN Pharma-ceuticals公司，用时以1∶100稀释;异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白抗体购自德国Cappel，ICN Biochemicals公司，用时以1∶50稀释.

    1.2 动物的免疫  15μg纯化的电鳐乙酰胆碱受体中加入完全弗氏佐剂，注射于9只小鼠尾根部皮下，3，5周后分别以15μg纯化的电鳐乙酰胆碱受体加入不完全弗氏佐剂行加强免疫;对照组3只小鼠只注射完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂.

    1.3 抗乙酰胆碱受体抗体的测定  应用放射免疫方法测定小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体的滴度. 将2nmol25 I-α-银环蛇毒素混合入200μL小鼠乙 酰胆碱受体粗提液内，在4℃条件下标记4h，加入5μL动物血清，4℃过夜，以过量的羊抗人免疫球蛋白血清沉淀小鼠乙酰胆碱受体-抗体复合物，用磷酸盐缓冲液洗涤后，在γ计数仪上测定放射比活性.抗体滴度用每升α-银环蛇毒素结合摩尔数表示.

    1.4 骨骼肌抗乙酰胆碱受体抗体结合性测定  应用免疫荧光技术观察小鼠骨骼肌中抗乙酰胆碱受体抗体的结合性.将小鼠骨骼肌冰冻切片并以丙酮固定后，用20g/L牛血清白蛋白封闭15min，加入羊抗人免疫球蛋白G，作用45min，洗涤，加入异硫氰酸荧光素标记的兔抗羊免疫球蛋白抗体，继续作用45min，观察结果.

    2 结果

    2.1 小鼠血清抗乙酰胆碱受体抗体滴度  在行第2次加强免疫注射电鳐乙酰胆碱受体3d后，心脏穿刺采血，检查血清中抗体滴度.9只实验小鼠的抗乙酰胆碱受体抗体滴度为155～539pmol（Fig1）.

    2.2 骨骼肌抗乙酰胆碱受体抗体的结合  免疫荧光观察结果表明，小鼠肌肉冰冻切片中可见抗乙酰胆碱受体抗体（Fig2略）.

    3 讨论

    自从1973年Patrick和Lindstrom  ［8］ 应用电鳗乙酰胆碱受体免疫家兔建立第一个重症肌无力动物模型以来，已经在小鼠、大鼠、豚鼠、猴及猪等多种动物中成功地建立了重症肌无力模型，为研究重症肌无力的发病机制和免疫提供了有效途径.制作出与人重症肌无力更为接近的实验性自身免疫性重症肌无力动物模型已成为紧迫的研究课题.较为理想的动物模型应含有人免疫球蛋白、主要组织相容性抗原和乙酰胆碱受体基因.1994年Lonberg等 ［5］

    建立了表达人免疫球蛋白的转基因小鼠，这使制作 这种新的重症肌无力动物模型成为可能.人免疫球蛋白转基因小鼠无论接受何种乙酰胆碱受体的免疫刺激，均将产生人免疫球蛋白，得到的重症肌无力动物模型在免疫学方面更接近人重症肌无力.本研究结果表明，人免疫球蛋白转基因小鼠在接受电鳐乙酰胆碱受体刺激后，小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度在155～539pmol范围内，仅为抗电鳐乙酰胆碱受体（免疫原）抗体滴度（6～296nmol） ［4］ 的0.2%，与Berman等 ［9］ 研究结果相一致.免疫荧光观察证实，小鼠肌肉中存在人抗乙酰胆碱受体抗体.上述结果表明，电鳐乙酰胆碱受体作为免疫原，可刺激人免疫球蛋白转基因小鼠产生人抗乙酰胆碱受体抗体，它可与肌肉组织中乙酰胆碱受体结合，导致乙酰胆碱受体功能失调，最终诱导实验性自身免疫性重症肌无力.人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力动物模型的建立及其机制的阐明，为研究制作理想的重症肌无力动物模型奠定基础，亦为获得人源性抗乙酰胆碱受体单克隆抗体及基因工程抗体提供了新的途径.

    ［参 考 文 献］

    ［1］ Meng F，Stassen M，Schillberg S，et al..Constructionand characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravis ［J］.Autoimmunity，2002，35:125.

    ［2］ De Baets M，Stassen M.The role of antibodies in myas- thenia gravis［J］.J Neurol Sci，2002，202:5.

    ［3］ Lennon VA，Lindstrom JM，Seybold ME.Experimental autoimmune myasthenia:a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigs［J］.J Exp Med，1975，141:1365.

　［4］ 李红花，金桂花，孟繁平，等.重症肌无力转基因小鼠模型的建立［J］. 延边大学医学学报 ，2006，29（2）:79.

    ［5］ Lonberg N，Taylor LD，Harding FA，et al..Antigen-  specific human antibodies from mice compressing four distinct genetic modifications［J］.Nature，1994，368:856.

    ［6］ Fishwild DM，O'Donnell SL，Bengoechea T，et al.. High-avidity IgGκmonoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic mice［J］.Nat Biotechnol， 1996，14:845.

    ［7］ 杨康鹃，孟繁平，de Baets M.电鳐乙酰胆碱受体的分离 和纯化［J］. 延边大学医学学报 ，2004，27（1）:5.

    ［8］ Patrick J，Lindstrom J.Autoimmune response to acetyl- choline receptor［J］.Science，1973，180:871.

    ［9］ Berman PW，Patrick J.Experimental myasthenia gravis:A murine system［J］.J Exp Med，1980，151:204.