Y染色体AZF基因缺失检测与男性不育

来源:岁月联盟 作者:潘云 时间:2010-07-12

【关键词】  Y染色体 少精液症 基因缺失 不育 男性

  目前世界上已婚育龄夫妇中约10%~15%的夫妇不育,其中男性不育因素约占50%,引起男性不育常见原因有营养不良、内分泌疾病、环境毒物、生殖道炎症、精索静脉曲张、隐睾、核型异常(克氏征)及免疫异常等因素,其中由于遗传缺陷包括基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍约占30%以上[1]。除输精管梗阻、腮腺炎病毒感染等明确原因外,还有相当一部分精子发生障碍的男性不育找不出病因,因此有关原发性无精子症及严重少精子症的遗传因素日益受到重视。随着对精子发生的细胞遗传学和分子生物学等领域的深入研究以及分子生物学检验技术的,人们逐步认识到引起无精症的基因——无精因子(azoospermia factor,AZF)位于Y染色体长臂(Yq),这一区域的异常和大多数原发性无精子症密切相关。现将Y染色体微缺失(AZF基因缺失)与男性不育的研究状况作如下综述。

  1  Y染色体上AZF区域及基因分布

  人类的Y染色体由长臂(Yq)和短臂(Yp)构成,其包含了约2%的基因。Y染色体对性发育和精子发生是必需的,Y染色体上特殊基因的缺失、点突变和微重排等异常均可影响男性生精功能。由于Y染色体的基因都是单倍体,Y染色体的微缺失即使是一个基因也有可能产生明显效应[2],Dohle等[3]对原发性无精子症和少精子症患者进行分析,均发现存在Y染色体微缺失(Y chromosome microdeletions),提示Y染色体微缺失可能是男性原发不育的一个重要遗传因素,某些基因片段的丢失可能造成生精障碍,1976年Tiepolo[4]发现男性不育患者Y染色体长臂1区1带(Yq11)存在着断裂现象,因此提出Y染色体长臂存在与精子发生相关基因,并命名为AZF,AZF为多基因家族,Vogt等[4]发现,Y染色体微缺失存在于3个不同的区域,即Yq11的近段、中段和远段,因此认为在这3个区域内均存在AZF基因,分别命名为AZFa,AZFb和AZFc。有研究人员[5]发现在AZFb和AZFc之间还存在AZFd,但该区是否存在仍有争议。

  1.1  AZFa区 

  AZFa位于Yq近侧缺失区间interval 5内,估计长度为1~3Mb。AZFa包含的基因有USP9Y,DBY,TB4Y和UTY,这些基因均与X染色体有同源性并在许多组织中表达,也是男性遗传性不育相关的AZFa候选基因[6],其中USP9Y是AZFa的最佳候选基因。USP9Y是最早发现的AZFa候选基因,大小为159kb含有46个外显子,对原发性无精症和严重少精症患者进行USP9Y检测时发现USP9Y缺失的病例均表现为原发性无精子症,表明USP9Y的微缺失将导致生精障碍及睾丸发育不良,但其缺失率较低。单纯AZFa的缺失较少见,约占Y染色体微缺失的1%~5%,但AZFa缺失的患者最为严重,大多表现为唯支持细胞综合征(SCOS),同时有睾丸体积的缩小。

  1.2  AZFb区 

  AZFb位于Y染色体缺失区间interval 5~6近侧端,大小约1~3Mb。已识别的AZFb区基因有:RBMY(RNA binding motif Y chromosome),CDY(chromodomin Y),XKRY,SMY和eif-1。最佳候选基因RBMY是第一个被确定与精子发生相关的基因。RBMY家族,是1993年英国学者Ma等[7]首次分离和克隆定位于Y染色体长臂的DNA片段,该片段的氨基酸序列与RNA结合家族中的识别基序(RNA recognition motif,RRM)具有明显的同源性。RRM在睾丸内特异性表达,研究表明[8]所有AZFb缺失的男性均未发现RBMY基因的完全缺失,提示RBMY的活性拷贝是不能被去除的。另外CDY基因也是与精子发生密切相关的基因家族,它包括3个成员,分别为CDY1major、CDY1minor和CDY2。CDY的功能目前还不完全清楚,可能与精子的发生有关,尤其CDY1作用较明显。AZFb基因全部缺失的患者表现为生精阻滞,主要停留在精母细胞或精子细胞阶段,部分缺失时,临床表现多样化,包括SCOS,无精子症或少精子症;如果同时伴有AZFa或AZFc的缺失,则表现为SCOS或生精阻滞。

  1.3  AZFc区 

  AZFc位于异染色质邻近异染色质区,长度约为1.5 Mb,近侧区又划分出AZFd区。目前已识别的AZFc基因有DAZ(deleted in azoospermia,DAZ),PRY,BPY2,TTY2,CDY和RBMY。最佳候选基因是DAZ基因,DAZ为多拷贝基因,称为DAZ家族[9]。DAZ编码的蛋白质与RBMY基因家族编码的蛋白质有相似的结构并在生精细胞中特异表达,表明其可能与RNA的代谢相关。DAZ只在睾丸特异性表达,表明DAZ基因只参与男性特有的生理过程,从另一方面也支持了DAZ是影响精子生成的重要基因的假设。AZFc基因缺失是精子生成障碍的最常见原因[3],约占Y染色体微缺失的60%,所以AZFc区缺失常作为原发性无精子症和严重少精子症患者的主要筛查基因。AZFc缺失的患者临床表现多种多样,可表现为无精症,也可表现为精子计数正常但伴有精子形态异常[10]。AZFc微缺失的患者为轻度少精或精子数目。

  1.4  AZFd区 

  AZFd是新发现的位于AZFb和AZFc之间的第四个AZF区。AZFd缺失多见于轻度少精症,其基因型和相关表型有待进一步研究。

  2  Y染色体AZF缺失发生机制
       
  Y染色体AZF缺失的机制说法不一,主要认为:Y染色体在精子发生过程中,由于胚细胞快速分裂,与卵子发生过程相比具有更多的突变机会。Y染色体不能像常染色体一样进行DNA修复。Y染色体是单倍体,故一个基因缺失就能发生效应。另外X和Y染色体之间或Y染色体本身不平衡的姐妹染色体单体交换时,同源或相似的重复序列之间异常重组。Siffroi等[11]证明Y染色体长臂大的缺失与Y染色体的不稳定性有关。但也有学者认为[12],Y染色体AZF基因缺失形成是一种随机事件,不依赖Y染色体出现的背景,可能是其它遗传或环境因素所致。

  3  Y染色体AZF基因缺失检测状况
      
  男性不育患者中Y染色体微缺失发生率约为10%[13],报道[14]为1%~55.5%,之所以缺失频率范围如此大,可能有以下几点原因:①研究对象入选的标准不同,可能是无精子症、少精子症和不育症,但精子计数正常以及这几种人群的不同组合。无精和少精只是一个症状,本身就代表不同病因的不均一性。②选取STS标记位置的密度及位置不同。③病史不清,实验室检查不全面。④不同地域、种族间可能存在差异。Vogt[4]1992~1996年发表的19篇文献,AZF缺失平均发生率为10.2%,Oliva等[15]在186例不育者中发现Y染色体微缺失10例(5.38%)、无精子者占16%(8/50),少精子占1.47%(2/136);谭超等[16]对成都地区42例原发性男性不育症患者AZF基因研究表明微缺失的总体发生率为19.1%,而AZFc区缺失要比AZFa及AZFb区更常见,分别占缺失的47.6%、11.9%及23.8%。刘雅峰等[17]对广州地区175例原发性生精障碍患者AZF研究结果总缺失率为10.9%,其中AZFc区占缺失的比率高达78.9%。Foresta等[18]在对男性不育症患者Y染色体分析时发现无精子症患者的AZFc区基因缺失率最高,缺失的区域以AZFc的DAZ家族最多见,提示AZFc区的缺失是整个AZF缺失区域的热区,可将此基因片段缺失作为无精子症和严重少精子症病因筛选的主要候选基因。

  4  Y染色体AZF基因检测方法及临床意义
   
  目前,针对AZF基因缺失的检测主要采用Y染色体特异性序列标签位点(sequence tagged sites,STS)引物行PCR扩增,检测光镜下分辨不出来的Y染色体微缺失。作为基因物理图谱的STS是一段已知核苷酸序列的DNA片段,可真实反映染色体上不同的基因序列,诊断Y染色体微缺失的基因诊断策略是设计引物对AZFa、AZFb、AZFc 3个区域进行缺失筛查,每个区域选择2~3个STS位点进行PCR扩增,既在同一PCR反应体系中加入数对AZF区域STS引物,如果这些引物的退火温度相近并且所覆盖的区域不重叠,就可以同时扩增一份DNA样品中不同基因位点的不同序列,AZF基因的某一片段则相应的电泳图谱上这一区带就会消失,一旦发现缺失,单独扩增缺失位点以确认[19]。不同的研究者进行Y染色体AZF缺失分析时选用的STS数目有很大的差异,从5~118个不等,检测时应用多少个Y染色体特异性STS位点及其代表性,国际上尚存争议,缺乏统一的标准,但将AZF分为AZFa、AZFb、AZFc 3个区域已被大部分的研究者所接受。欧洲标准化AZF缺失筛查推荐使用3个对照[20]:1份正常男性DNA为阳性对照,1份正常女性DNA为阴性对照,无菌蒸馏水为空白对照。女性样品用以监控实验结果的特异性和污染情况,水空白对照是用来检测试剂是否被污染。设计的引物包括:sY14(SRY)、ZFX/ZFY、sY84、sY 86、sY 127、sY 134、sY 254、sY 255。采用上述位点可以检测到目前已知的95%以上的Yq微缺失,因此这套设计完全满足常规检测。AZF缺失基因蕊片检测技术是未来发展方向。


     
  AZF缺失的检测使临床上一些原因不明的无精症或少精症患者从分子水平上明确了病因,为临床医师的诊疗过程提供了临床依据。目前,对无精少精患者生育的有效是单精子卵泡内注射(intracytoplasmic sperm injection,ISCI),对这一群体的遗传学咨询及筛查是十分必要的:①无精子和少精子存在的遗传学问题如Y染色体微缺失可垂直传给男性后代,可通过术前筛查进行种植前遗传学诊断切断遗传途径。②诊断Y染色体微缺失,找到精子生成障碍的真正原因,从而避免不必要的药物及手术治疗。③诊断无精子症患者Y染色体微缺失的种类,指导睾丸活检。④由于AZFc缺失可能出现随时间进行性精子数量减少的现象[21],所以携带AZFc缺失的少精症应考虑精液的保存,避免将来不必要的治疗。

  5  结束语

  大多数原发性无精子症和原发性严重少精子症病人的Y染色体大体上是完整的,AZF缺失并非一概不育,但Y染色体AZF缺失,可引起严重生精障碍,AZF缺失检测成为诊断遗传性不育的重要技术手段。近年来男性原发性不育患者就诊率的不断升高和辅助生殖技术规模的不断扩大,开展AZF基因缺失检测在临床工作中显得越来越重要。在行AZF检测前应排除以下引起不育的因素:生殖道的感染、染色体数目及结构异常、梗阻性无精子症、精索静脉重度曲张、内分泌激素的异常、免疫性不育及隐睾等先天性发育异常引起的不育症。随着研究的不断深入,将进一步明确各基因型的临床特征,对AZF基因缺失是否存在地域及种族差异,Y染色体基因编码的相关蛋白质都待进一步研究。

【】
    [1]Chang PL, Sauer MV, Brown S. Y chromosome microdeletion in a father and his four infertile sons[J]. Hum Reprod,1999,14(11):2689-2694.

  [2]Hargeave TB. Genetie basis of male fertility [J]. Br Med Bull,2000,56(3):650-671.

 [3]Dohle GR, Halley DJJ, Van Hemel JO, et al. Genetic risk factors in infertile men with severe oligozoospermia and azoospermia [J]. Hum Reprod,2002,17(1):13-16.

  [4]Vogt PH. Human chromosome deletions in Yq11, AZF candidate genes and male infertility:history and update [J]. Mol Hum Reprod,1998,4(8):739-744.

  [5]Quintana-Murci L, Krausz C, Heyer E, et al. The relationship between Y chromosome DNA haplotypes and Y chromosome deletions leading to male infertility [J]. Hum Genet, 2001,108(1):55-58.

  [6]Kunej T, Zorn B, Peterlin B. Y chromosome microdeletions in infertile men with cryptorchidism [J]. Fertil Steril,2003,79(suppl3):1559-1565.

  [7]Ma K, Inglis JD, Sharkey A, et al. A Y chromosome gene family with RNA binding protein homology:candidates for the azoospermia factor AZF controlling spermatogenesis [J].Cell,1993,75(7):1287-1295.

  [8]Foresta C, Moro E, Ferlin A.Y chromosome microdeletions and alteration of spermatogenesis[J]. Endorrev, 2001, 22(2):226-239.

  [9]Ferlin A, Bettella A, Spolaore D, et al. Analysis of the DAZ gene family in cryptorchidism and idiopathic male infertility [J]. Fertil Steril, 2004,81(4):1031-1038.

  [10]Huck lenbroick K, Gromoll J, Heinrich M, et al. Partial deletions in the AZFc region of the Y chromosome occur in men with impaired as well as normal spermatogenesis [J]. Hum Reprod, 2005, 20(1):191-197.

  [11]Siffroi JP, Le Bourhis C, Krausz C, et al. Sex chromosome mosaicism in males carrying Y chromosome long arm deletions [J]. Hum Reprod,2000,15(12):2559-2562.

  [12]Vogt PH. AZF deletions and Y chromosmal haplogroups: history and update based on sequence [J]. Hum Reprod Update,2005,11(4):319-336.

  [13]Umeno M, Shinka T, Sato Y, et al. A rapid and simple system of detecting deletions on the Y chromosome related with male infertility using multip-lex PCR [J]. J Med Invest,2006,53(1):147-152.

  [14]Janet M, Pak C, Lucinda V, et al. AZF microdeletions of the Y chromosome and in vitro fertilization outcome[J]. Fertil Sterl,2004,81(2):337-341.

  [15]Oliva R, Margarit E, Ballesca JL, et al. Prevalence of Y chromosome microdeletion in oligospermic and azoospermia candidates for intracytoplasmic sperm injection [J]. Fertil Steril,1998,70(3):506-510.

  [16]谭超,钟影,李建平,等.成都地区原发男性不育患者AZF基因微缺失研究[J].四川医学,2004,25(11):1173-1174.

  [17]刘雅峰,欧建平,周灿权,等.广州地区不育男性Y染色体无精子因子微缺失的筛查[J].中华医学遗传学杂志,2007,24(5):564-566.

  [18]Foresta C, Moro E, Ferlin A. Prognostic value of Y deletion analysis. The role of current methods [J]. Hum Reprod,2001,16(8):1543-1547.

  [19]Chiang HS, Wei HJ, Chen YT, et al. Genetic screening for patients with azoospermia and seven oligoasthenospermia [J]. Int J Androl,2000,23(suppl1):20-25.

  [20]Simoni M, Bakker E, Krausz C. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y chromosomal microdeletions [J]. Int J Androl,2004,27(4):240-249.

  [21]Vogt PH. Genomic heterogeneity and instability of the AZF locus on the human Y chromosome [J]. Mol Cell Endocrinol,2004,224(1-2):1-9.