肿瘤多药耐药相关的跨膜转运蛋白的研究现状

【关键词】  肿瘤
　　肿瘤细胞表现多药耐药性往往是导致临床化疗失败及生存预后差的主要原因之一。多药耐药是肿瘤细胞耐药的主要形式，肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）是指一种药物作用于肿瘤细胞使之产生耐药性后，该肿瘤细胞逐渐对未接触过的、结构无关、作用靶点和机制不同的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。目前研究认为，肿瘤产生MDR的分子机制主要有以下几方面:（1）跨膜药泵基因的扩增或过度表达，跨膜转运蛋白的高表达，从而促进药物外排及药物的亚细胞分布改变以降低药物浓度。（2）代谢转化改变，如细胞内一些蛋白酶的改变引起细胞解毒功能增强。（3）药物作用靶点改变，如核酶DNA拓扑异构酶Ⅱ（topoisomeraseⅡ，TOPOⅡ）含量减少或性质改变，导致对TOPOⅡ为靶点的抗肿瘤药物耐药。（4）其他机制还包括凋亡相关通路改变、细胞增殖速率改变、损伤修复增强及体内药代动力学因素改变等。这些机制常多种同时存在，但多以一种为主，同时不同机制常相互影响。近年来对MDR产生机制中跨膜转运蛋白的研究不断深入，先后发现了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药蛋白（multidrug resistance pro-tein，MRP）、肺耐药相关蛋白（the lung resistance-related protein，LRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）它们均具有药物排出泵功能。
      
　　下面就对与MDR相关的这四种跨膜转运蛋白的生物学特性、结构特性、生理功能、耐药性质及耐药机制目前的研究现状作一综述。
     
　　1 P-糖蛋白（P-gp）
     
　　1.1 P-gp的生物学特性  1976年Juliano等 ［1］ 首先观察到具有MDR表型的仓鼠卵巢（CHO）细胞中有一种与耐药程度呈正相关的高分子糖蛋白，命名为P-糖蛋白。P-gp由mdr1基因编码，人类的mdr1基因位于7，q21.1，P-gp的cDNA长度为4.3kb，编码的蛋白质由1280个氨基酸残基组成，分子量为170kD，故又名为P-gp170或P170。
     
　　1.2 P-gp的结构特点及生理功能  P-gp是一种ATP依耐性跨膜转运蛋白，是ABC转运蛋白超家族成员之一，具有ABC全转运蛋白结构，即共含12个跨膜区，可分为左右几乎相等的两部分，其分子每部分都有1个疏水区及1个亲水区，疏水区由6个跨膜区（membrane spanning domains，MSDs）构成，它提供结合底物的特异性，而位于胞浆内的亲水区含1个亲水性核酸结合区（nucleotide-bind domain，NBD），该结构上有1个ATP结合位点。NBDs含有特征性基团WalkerA和B，间隔90～120个氨基酸，存在于所有ATP结合蛋白中，起传递能量以转运底物穿出细胞膜的作用 ［2］ 。P-gp定位于胞质膜，在人体正常组织中广泛表达，一些研究表明在成人，高水平的P-gp的mRNA表达于肾上腺皮质和髓质，也高表达于肾脏及胎盘，而在肺、肝脏、小肠和结肠中呈中等表达，在其它组织中它低水平表达 ［3，4］ 。定位研究表明mdr1正常表达于肝脏、胆小管、胰腺小管、肾脏近端小管。在生理状态下，P-gp与防止毒素入侵及细胞分泌类固醇 激素有关，其底物可能是有细胞毒性的代谢物和化合物。位于血脑屏障毛细血管腔表面的P-gp可防止细胞毒素穿透内皮，在体外给药时，P-gp可减少脑中的药物浓度及药物的中枢神经系统效应 ［5］ 。有研究发现，P-gp的抑制剂如奎尼丁、环孢霉素等可增强P-gp底物的中枢神经系统效应，在实验中奎尼丁显著降低了血清中的丁哌卡因的浓度，而未影响脑中的浓度，由此可表明P-gp可抑制丁哌卡因通过血脑屏障。位于睾丸和胎盘部位的P-gp也起到抵抗细胞毒素侵害的功能。有研究表明P-gp能调节口服药物的生物利用度。
     
　　1.3 P-gp的耐药机制  P-gp能够通过脂质双分子层有效的消除细胞毒性药物和许多常用药物，P-gp的跨膜区域结合带有中性正电荷的疏水性药物底物，可能直接从脂质双分子层递呈给转运蛋白。P-gp的表达与蒽类化合物、长春碱类、紫杉醇类和鬼臼毒素类的耐药相关。P-gp作为一种ATP依耐性跨膜蛋白，可能量依耐性地将药物泵出细胞外，并减少药物转运入细胞内，是细胞内地药物蓄积减少;还可使细胞内药物再分布，致药物集聚于药物作用无关的细胞器如溶酶体内，进一步减少作用靶点部位的药物浓度，从而导致耐药。研究认为P-gp在转运一个药物分子时发生两次ATP水解事件，第一次是在跨膜区域结合底物后激活P-gp的ATP酶活性时发生，引起蛋白质构象变化，以释放底物到膜外侧部分或者是细胞外空间，ATP位点的第二次水解则是重置转运蛋白，以利于再次转运 ［6，7］ 。另外P-gp还可延迟凋亡级联反应，提高肿瘤细胞存活率 ［8］ ，并能保护耐药细胞免于细胞毒性药物及Fas配体诱导的多种形式的caspase依赖性凋亡 ［9］ 。
     
　　2 多药耐药蛋白MRP
     
　　2.1 MRP的生物特性  1992年Cole等 ［10］ 在耐阿霉素小细胞肺癌细胞系H69AR中发现了一种与多药耐药性表型获得与缺失相关的蛋白，后证明它也属于ABC超家族转运蛋白，命名为多药耐药蛋白MRP。因它是人多药耐药蛋白家族MRPs成员之一，也就是该家族中的MRP1。原位杂交显示人MRP的基因位于16P13.1，其mRNA为7.8～8.2kb，编码一个由1522个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子量为190kDa。
     
　　2.2 MRP的结构特点及生理功能  MRP与P-gp一样属于ABC转运蛋白，但它在结构上具有以下独特的特点 ［2］ :1、MRP具有3个MSDs，其构像为MSD1-MSD2-NBD1-MSD3-NDS2。2、在P-gp及其他一些真核生物ABC转运蛋白中位于NH2端NBD即NBD1的walkerA和walkerB之间的13个氨基酸，在MRP却位于COOH端的NBD（NBD2）中。3、MRP其分子量较其他ABC转运蛋白大，在其NH2端较其他蛋白多了一约250个氨基酸残基组成的序列。MRP在体内广泛分布于多种上皮细胞、肌细胞及肺泡巨噬细胞中，与此推测MRP具有保护机体抵御外来活性物质（异生质）的排出泵的作用 ［11］ 。此外在许多具有内分泌功能的细胞如肾上腺皮质细胞、胰岛细胞、胎盘滋养层细胞、睾丸及卵巢中分泌睾丸素的细胞，都有MRP的高表达，提示MRP可能参与激素的转运 ［11］ 。还有研究 ［12］ 发现塞尔托利氏（sertoli）细胞基膜内高表达的MRP，可通过睾丸小管将有害物质排出从而保护生殖细胞。还发现 ［5］ 脉络丛上皮细胞中的MRP可起防止药物进入的作用。
     
　　2.3 MRP的耐药机制  MRP在小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺肿瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、纤维肉瘤及各型白血病的肿瘤细胞中都有过度表达 ［2］ 。MRP介导的MDR分子机制与P-gp基本一致，也是通过降低胞内化疗药物的浓度，且在一些特定细胞株中也发现MRP可改变药物在细胞内的分布，使药物集中分布于胞质囊或核周高尔基样区域中，有效降低药物的核质分布比例。但区别于P-gp，MRP并不能独立完成未经修饰地化疗药物的天然产物，但却能转运生物转化后与谷胱苷肽GSH结合的产物，随着GSH的耗尽，MRP介导的对长春碱类和蒽环类药物耐药将消失。由此可肯定MRP与GSH共同介导耐药性的产生，目前认为药物首先通过谷胱苷肽S转移酶和GSH结合，然后由MRP转运出细胞，故称MRP为一种药物排出泵不准确，确切讲MRP是一种GSH-X泵 ［14］ 。
     
　　3 乳腺癌耐药蛋白BCRP
     
　　3.1 BCRP的生物学特征  1990年Chen等用阿霉素（adri-amycin，Adr）加维拉帕米（verapamil，Vp）从人乳腺癌细胞株MCF-7诱导得到一株MDR细胞MCF-7/AdrVp该细胞株对抗肿瘤药物均能产生交叉耐药，后证实MCF-7/AdrVp细胞株无P-gp、MRP、LRP的过度表达。到1998年Dovle等 ［14］ 用RNA指纹分布技术研究比较乳腺癌耐药细胞MCF-7/AdrVp和亲代细胞MCF-7的mRNA表达差异，结果在乳腺癌耐药细胞MCF-7/AdrVp中发现了一2.4kbmRNA的过度表达能翻译一由655个氨基酸残基组成的跨膜转运蛋白。因该蛋白首先在乳腺癌细胞中发现，故命名为乳腺癌耐药蛋白。后Allikmets等 ［15］ 和Miyake等有分别从人胎盘组织和耐米托蒽醌的人结肠癌细胞S1-M1-80中克隆得到BCRP基因，因而BCRP又称为胎盘特异性ATP结合盒转运分子（placenta-specific ATP-binding cassette transporter，ABCP）和耐米托蒽醌转运分子（mitoxantrone resis-tance transporter，MXR）。人的BCRP基因位于4q22，BCRP的cDNA长度为2.4kb，其编码的蛋白质由655个氨基酸组成。BCRP的分子量约为72.6kD。 
     
　　3.2 BCRP的结构特点及生理功能  BCRP与P-gp和MRP一样同属于ABC转运蛋白超家族，也存在ATP结合盒，并具有ATP依耐性药物外排功能。但在结构上BCRP仅相当与P-gp分子的一半，它仅有6个跨膜区和1个ATP结合位点，故被称为不完全转运分子（half transporter）。基于大量mdr1基因和MRP基因的突变研究表明，P-gp和MRP均许2个ATP结合区和广泛的跨膜区才能发挥作用。过去有研究推测BCRP可能是与细胞膜上一种未知组分共同组成异二聚体发挥作用 ［14］ ，但至今未发现此种细胞膜组分。而另一种假设则认为BCRP是通过其单体形成同二聚体或多聚体发挥功能。这一假设已为Kage等 ［16］ 人所证实，他们的研究发现BCRP单体以二硫键连接形成同二聚体，而此同二聚体是BCRP发挥功能所必需的。与P-gp相似，BCRP在正常组织中也分布广泛，且主要分布于具有分泌和排泄功能的组织如胎盘合体滋养层、小肠和结肠上皮、肝细 胞膜胆小管面中 ［17］ 。在小肠和结肠上皮中的分布提示BCRP可能通过返运从肠腔进入的外源性物质如药物等来调节吸收，防止可能发生的毒性反应 ［17］ 。另外有研究发现BCRP在胎盘组织中表达丰富，提示BCRP在胎盘屏障的形成过程中可能发挥重要作用。BCRP也可能参与肝脏解毒及血脑屏障的形成。 3.3 BCRP的耐药机制  BCRP并非乳腺癌所特有，以Mx诱导的人骨髓瘤细胞株RPM18226、人小细胞肺癌细胞株GLC4、人结肠癌细胞株S1-M1-3.2都发现了有BCRP的过表达 ［18］ 。其耐药谱包括了米托蒽醌、阿霉素、柔红霉素、鬼臼乙叉苷、拓扑特肯等，且对长春新碱、紫杉醇无交叉耐药。其耐药分子机制与P-gp及MRP基本相似，即通过主动外排药物及降低药物核质分布比例达到MDR。但BCRP也具有自身的特点 ［16］ :首先BCRP单体之间通过二硫键形成同二聚体，使结构近似于一完全转运蛋白，而后在发挥药物排出泵作用。此外BCRP也具有与前两种耐药蛋白不同的药物结合位点。Honjo等 ［19］ 研究表明，BCRP的482位氨基酸残基的点突变能改变BCRP的底物特异性，由此推测BCRP上第3跨膜区内的482的氨基酸可能使BCRP药物结合位点的一部分。 
　　4 肺耐药相关蛋白（LRP）
     
　　4.1 LRP的生物学特性  1993年Scheper等 ［20］ 用多柔比星（阿霉素）从人NSCLC（非小细胞肺癌）细胞株SW-1573选择到一株MDR细胞SW-1573/2R120，该细胞株对足叶乙苷、长春新碱、短杆菌肽D等多种化疗药物产生耐药。发现在无P-gp过量表达的情况下，仍出现能量依耐性药物蓄积能力的下降并发现一种新蛋白的表达，因最早发现于肺癌耐药细胞株中，故命名为肺耐药相关蛋白LRP。LRP基因定位于16q11.2，其cDNA为2688bp组成的开放读码框架，编码一个由896个氨基酸组成的蛋白质，其分子量约为110kD。
     
　　4.2 LRP的结构特点及生理功能  与前三种耐药蛋白不同，LRP不属于ABC转运蛋白超家族，1995年Scheper等发现LRP基因编码的氨基酸序列与“穹隆主体蛋白（major vault protein，MVP）”基本相同，由此推测LRP可能就是人的MVP。MVP是重要细胞器的主要组成部分，穹隆的功能可能与胞核与胞浆的转运有关。穹隆蛋白由240kD，193kD，104kD三个蛋白及一种独特的穹隆RNA（VRNA）所组成，该蛋白如桶状，有两个中心和分叶状的壁，中间是空的，有两个伸出的帽状结构和中部内陷的腰部，LRP是一种主要的穹隆蛋白，可能通过双向核质转运产生MDR。LRP可以分布于多种正常组织中，如血管上皮、消化道上皮、支气管上皮、肾小管上皮等细胞以及吞噬细胞。这些组织均具有分泌和排泄的功能，因此推断正常组织中的LRP可能发挥清除外界活性物质和毒物的作用 ［21］ 。
     
　　4.3 LRP的耐药机制  LRP可以在几乎所有类型的肿瘤细胞中过量表达，它作为人的穹隆主体蛋白通过参与转运过程，进而在肿瘤化疗过程中诱导肿瘤细胞的MDR，其机制可能是:（1）阻止以细胞核为靶点的药物进入细胞核，起到中间关卡的作用，组织药物进入细胞核内或者将已进入核内的药物通过转运载体重新运出细胞核。（2）将细胞浆中的药物转运至运输囊泡，从而使药物呈房室性分布，并通过胞吐机制将药物排出细胞，降低细胞内的药物浓度，最终产生耐药。有研究证明LRP不仅对蒽环类、生物碱、表鬼臼毒素类产生耐药，也对以肿瘤细胞的DNA为作用靶点的非P-gp和MRP介导耐药的顺铂、卡铂、烷化剂等药物产生耐药，所以一般认为LRP主要通过核屏蔽机制引起MDR。 
　　5 展望
       
　　MDR已成为肿瘤化疗过程严重的障碍，而由与MDR相关的这四种跨膜转运蛋白所介导的多药耐药又是其中一个重要的机制。因此深入了解这四种耐药蛋白，对寻求克服它们介导的MDR的产生，提高肿瘤患者化疗敏感性及改善病人生活质量是十分有意义地。目前的研究已发现了一些有效的逆转剂，如维拉帕米、环孢素A、三苯氧胺、类固醇激素可逆转由P-gp介导的MDR，霉菌毒素C（FTC）则可逆转由BCRP介导的对阿霉素、米托蒽醌和拓扑特肯的MDR。但这些逆转剂因其较多的副作用，还不能投入临床使用。目前我们仍需进一步研究这些耐药蛋白的确切耐药机制，而且因为每种肿瘤往往表达多种耐药蛋白，故探究这几种跨膜转运蛋白之间的相互关系也是十分必要的。同时在研究由跨膜转运蛋白引起的MDR时也应与其他机制联系起来。
      
　　
     
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