系统性红斑狼疮患者高表达的CD154促进自身抗体分泌

               作者：李玉杰， 李幼姬， 张涤华， 许元文， 董秀清

【摘要】  【目的】 探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMC）CD154表达水平、及CD40/CD154对SLE患者分泌自身抗体的影响和地塞米松（Dex）对此的作用。【方法】 选择SLE活动期患者（10例）和正常对照者（11例），分离PBMC，检测其CD154的表达水平；培养PBMC，应用CD40 mAb和Dex进行干预，使用ELISA法检测培养液上清抗dsDNA水平。【结果】①活动期组PBMC CD154表达水平明显高于对照组6.4%±2.1% vs 1.5%±1.2%，(P< 0.05）；②活动期组培养液上清抗dsDNA抗体水平明显高于对照组[（11.8±6.8）U/mL vs （5.6±2.3）U/mL（RPMI 1640），（11.4±7.0）U/mL vs （6.3±2.1）U/mL（IgG），P均< 0.05]；③CD40 mAb使两组培养液上清抗dsDNA抗体水平明显增高[活动期组：（18.6±7.7）U/mL vs (11.8±6.9)U/mL，对照组：（8.3±4.4 ）U/mL sv（5.6±2.3) U/mL，P均< 0.05]。④在活动期组，Dex明显抑制CD40 mAb引起的PBMC培养液上清抗dsDNA抗体水平的增高[（8.8±5.2）U/mL vs（18.6±7.7）U/mL， P< 0.05]，使其低于非特异性处理时水平[（8.8±5.2）U/mL vs （11.8±6.8 ）U/mL， P< 0.05]；Dex不影响对照组。【结论】 活动期SLE患者PBMC表达的CD154水平升高，此能够促进抗dsDNA抗体的分泌，而Dex能够抑制其作用。

【关键词】  红斑狼疮，系统性； 自身抗体； CD154； 地塞米松

    Abstract: 【Objective】 To investigate the expression of CD154 on peripheral blood mononuclear cell (PBMC) and the effects to secretion of autoantibodies by CD154 and dexamethasone in the patients with systemic lupus erythematosus (SLE). 【Methods】 The PBMC from active SLE patients and healthy control were isolated and sent to measure expression of CD154 by flow cytometry, the left PBMC were cultured and treated with CD40 mAb or Dex. The supernatant concentration of anti-dsDNA antibody was measured by ELISA. 【Results】 (1) The expression of CD 154 on PBMC ( % ) in active SLE were higher than that in healthy control (6.4±2.1 vs 1.5±1.2, P< 0.05). (2) The supernatant concentration of anti-dsDNA antibody in active SLE were higher than that in healthy control [11.8±6.8 vs 5.6±2.3 (RPMI 1640), 11.4±7.0 vs 6.3±2.1 (IgG) U/mL, all P< 0.05]. (3) CD40 mAb could significantly increase the supernatant concentration of anti-dsDNA antibody in the two groups [18.6±7.7 vs 11.8±6.9 (active SLE), 8.3±4.4 vs 5.6±2.3 (control) U/mL all P< 0.05). (4) Dexamethasone could decrease the elevated supernatant concentration of anti-dsDNA caused by CD40 mAb in active SLE ( 8.8±5.2 vs 11.8±6.8 U/mL P< 0.05 ) to a lower level ( 8.8±5.2 vs 11.8±6.8 U/mL P< 0.05), but no effects to healthy control. 【Conclusion】 The expression of CD154 on PBMC were increase and could stimulate the secretion of anti-dsDNA in active SLE, and this effect were inhibited by Dex.

    Key words: lupus erythematosus, systemic; autoantibody; CD154; dexamethasone

    系统性红斑狼疮（systemic lupus eryther?鄄motosus, SLE)是一种多系统受累的自身免疫性疾病，以多克隆B细胞活化和产生多种自身抗体为特征，此种自身抗体的产生是抗原驱动和T细胞依赖性的，其外周血细胞具有高增殖特性[1,2]；而共刺激分子，特别是CD40/CD154在B细胞的功能调控中起重要作用，已有报道SLE患者外调血单个核细胞（peripheral blood mononnclear cell,PBMC）表达的CD154水平增高[3-5]，但少有CD154对B细胞抗体分泌功能影响的研究。我们应用流式细胞术检测SLE患者PBMC表达的CD154水平；并使用CD40 mAb刺激培养的PBMC，而使用Dex进行干预；采用ELISA法检测PBMC培养液上清抗dsDNA抗体的变化，探讨CD40/CD154在SLE的表达及其对B细胞分泌自身抗体功能的影响，判断Dex的可能作用。

    1   材料和方法

    1.1   研究对象

    ①活动期组:2003年1-3月收住本院肾内科SLE患者10人，均为新收住的SLE患者，符合美国风湿病学会1982年SLE诊断标准[6]，未应用大剂量糖皮质激素和/或其它免疫抑制剂，SLEDAI≥10分[7]，男性1例，女性9例，年龄20～68（33±14）岁，SLEDAI 10～27（16±5）分。②对照组:健康志愿者11人，全部女性，年龄19～31（25±4）岁。两组间年龄分布无显著性差异（P >0.05）。

    1.2   研究方法

    1.2.1   主要试剂   淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），RPMI 1640培养基（Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物有限公司），CD154/RPE反应液（DAKO公司），重组人IL-4（R&D公司），小鼠IgG（Zymed公司），小鼠抗人CD40单抗（R&D公司），地塞米松（Dex，Sigma公司）；抗dsDNA ELISA试剂盒（ZEUS Scientific公司）。

    1.2.2   标本采取与处理   新入院病人第2天晨空腹采取静脉血10 mL，立即注入含20 μL（250 U）肝素钠的无菌离心管，轻搓摇匀；1 000 r/min (r=15 cm)水平离心10 min，分离出血浆后，采用密度梯度离心法常规分离外周血单个核细胞（PBMC），用含100 mL/L新生牛血清的RPMI 1640培养基调配成浓度为106 / mL的细胞悬液，取500 μL进行流式细胞检测；取所余细胞悬液4 mL均分为4份，放入直径35 mm的培养皿，每份标本均加入IL-4（终浓度20 ng/mL），分为第1组（RPMI 1640组），第2组[IgG组 加入小鼠IgG（终浓度2.5 μg/mL）]，第3组[CD40 mAb组 加入小鼠抗人CD40单抗（CD40 mAb，终浓度2.5 μg/mL）]，第4组[Dex组 加入CD40 mAb（终浓度2.5 μg/mL）和Dex（终浓度10-5 mmol/mL）]；将上述处理后的细胞悬液放入培养箱，于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养24 h；将细胞悬液离心后，培养液上清冷藏（-20 ℃），用于检测抗dsDNA抗体含量。

    1.2.3   流式细胞检测   取分离好的PBMC，用PBS洗2次后加入CD154/RPE反应液10 μL，室温暗处孵育30 min；用PBS洗2次后加入PBS重悬，流式细胞仪检测每份样品中104细胞，表达CD154的阳性细胞数，得出阳性荧光细胞百分率（%）。

    1.2.4   培养液上清抗dsDNA抗体含量的检测   采用酶联免疫吸附分析法（ELISA），严格按照试剂盒说明书进行操作。

    1.3   统计学处理

    所有数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，应用SPSS 11.0进行分析，组间比较用方差分析（one way ANOVA），并进行两两比较；两组间比较用独立样本t检验，组内比较用配对样本t检验；以P<0.05为显著性差异标准。

    2   结   果

    2.1   SLE患者PBMC表达CD154水平

    活动期组SLE患者PBMC表达CD154为6.4%±2.1%，显著高于对照组的1.5%±1.2%（P<0.05）。

    2.2   CD40/CD154对B细胞分泌自身抗体的影响

    在两组内部，其PBMC培养液上清抗dsDNA抗体水平在RPMI 1640和IgG两组之间无明显差异（均P >0.05）；在非特异性处理（RPMI 1640和IgG）情况下，活动期组培养液上清抗dsDNA抗体水平明显高于对照组（均P< 0.05）；应用CD40 mAb后，两组培养液上清抗dsDNA抗体水平明显增高（均P< 0.05），在活动期组Dex能够抑制CD40 mAb引起的抗体水平增高（P< 0.05），甚至使其低于非特异性处理时水平（P< 0.05，表1）。

    3   讨   论

    3.1   SLE时CD40/CD154的功能改变

    CD40/CD154在体液免疫、细胞免疫和细胞内信号转导方面具有极为重要的作用，能够促进B细胞生长、克隆转化和抗原依赖性抗体产生，参与了SLE的发生和[8,9]。本研究发现活动期SLE患者PBMC CD154表达水平增高，提示了此与疾病活动性的关系。

    3.2   CD40/CD154对B细胞自身抗体分泌的影响

    SLE产生的多种自身抗体中，抗dsDNA（double stranded DNA）抗体具有高度特异性，被认为与SLE的发生有关：循环或黏附于多种器官的DNA，与循环抗DNA抗体反应，形成免疫复合物，激活炎症系统（如补体），在多器官、系统导致组织损害，引起免疫复合物（IC）介导的疾病[1]。大量研究证实，抗dsDNA抗体是诊断SLE的特异性指标，亦为疾病活动性的敏感指标，已成为评定临床状况和预后的指标，甚至可能成为先于临床表现具有指导诊断意义的标志物[10]。

    本研究结果表明，在非特异性处理情况下，活动期组PBMC培养液上清抗dsDNA抗体水平明显高于对照组（均P< 0.05）； CD40 mAb明显增高两组PBMC培养液上清抗dsDNA抗体水平（均P<0.05）；Dex明显抑制活动期组CD40 mAb促进抗dsDNA抗体合成的作用（P< 0.05），甚至使其低于非特异性处理时水平（P< 0.05）。研究证实，CD40/CD154和CD28/CD80:CD86在SLE自身抗体的产生中具有重要作用[9,11,12]，应用CD154单抗、CTLA-4Ig、CD80单抗和/或CD86单抗可以阻止狼疮的进展和抗dsDNA抗体的产生[13,14]。本研究结果说明，CD40/CD154能够促进抗dsDNA抗体的产生，其可能途径包括直接作用、间接通过上调CD28/CD80 ∶ CD86。Dex对CD40 mAb引起的抗dsDNA抗体分泌促进作用能够产生有效抑制，提示其可能通过抑制CD40/CD154和/或CD28/CD80:CD86及其继发改变等产生临床疗效。

    因此，SLE患者PBMC表达的CD154水平增高，其和CD40的配接促进了B细胞分泌抗dsDNA抗体，而Dex对此有明显抑制作用，可能在临床中起作用。

【】
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