辛伐他汀含药血清对U937单核巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响
作者：刘金来, 朱强锋, 郝宝顺
【摘要】 【目的】 探讨辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）表达与分泌的影响。【方法】 15只新西兰大白兔随机分为正常对照组（NL, n=5）、粥样硬化模型组（AS, n=5）和辛伐他汀含药血清组（SIM, n=5）。通过喂养高脂饲料，建立兔动脉粥样硬化模型后，予辛伐他汀药液灌胃，获得含药血清。分别予不同浓度含药血清（5%、10%、20%）培养U937单核细胞源巨噬细胞24 h，应用逆转录聚合酶链反应检测MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表达，以及应用酶联免疫吸附试验检测MMP-9及TIMP-1蛋白的分泌。【结果】与相同浓度AS组比较，5%、10%、20% SIM组U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9 mRNA表达均显著性降低（P值为0.005、0.041和0.013）；5%、10%、20% SIM组TIMP-1 mRNA表达无显著性差异（P值均 >0.05）。而与相同浓度AS组比较，不仅10%、20% SIM组MMP-9分泌显著性减少（P值分别为0.009和0.001），而且10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加 （P值分别为0.017和0.001）。 【结论】 辛伐他汀可抑制单核巨噬细胞MMP-9的表达和分泌，以及促进TIMP-1的分泌。
【关键词】 辛伐他汀； 巨噬细胞； 基质金属蛋白酶-9； 金属蛋白酶组织抑制因子-1
Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups, normal control group (NL, n=5), atherosclerotic model group (AS, n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM, n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%, 10%, and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group, 5%, 10%, and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005, 0.041, and 0.013), and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group, 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001), but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.
Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1
冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定，继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1, 2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）增多，金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP）减少，导致斑块内胶原降解，纤维帽变薄，是斑块稳定性下降的重要原因[4, 5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征有效，可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关［６］，但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响，以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。
1 材料与方法
1.1 材料准备
雄性纯种新西兰大白兔，体质量2.0~2.5 kg，购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞，购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片，购自默沙东公司，实验时溶解于蒸馏水灌胃。
RPMI 1640培养基，购自Gibco公司。新生牛血清，购自PAA公司。佛波酯（PMA），购自Sigma公司。Trizol reagent，购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒，购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物，由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒，购自RapidBio公司。
1.2 动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备
15只新西兰大白兔随机分为3组：正常对照组（normal, NL）、粥样硬化模型组（atherosclerosis group, AS）和辛伐他汀含药血清组（simvastatin group, SIM），每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周，其余各组予高脂饲料（1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料）喂养10周后，每组随机处死1只，证实有大动脉粥样硬化形成后，继续高脂喂养至12周，其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5 mg/kg，每天1次，灌胃14 d。末次给药前禁食12 h，给药后1 h颈动脉无菌取血，分离血清，同组动物血清混匀，0.22 ?滋m滤膜过滤灭菌，-80 ℃保存备用。
1.3 细胞培养及干预
U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基中，置于含5% CO2，37 ℃培养箱中，待细胞生长至接近融合时传代，2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL，接种于6孔培养板，加入PMA使终浓度为50 ng/mL，培养48 h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞，伸出伪足，贴壁生长。弃去旧培养基，PBS液洗涤后，予不含血清的RPMI 1640培养基继续培养24 h，弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清，5%、10%、20%粥样硬化兔血清，以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI 1640培养基，每组设3个平行组，培养24 h用于RT-PCR实验。
1.4 总RNA提取
吸净培养基，每孔加入1 mL的Trizol液，吹打裂解细胞，收集于无RNA酶离心管中，室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿,剧烈颠倒15 s，室温静置3 min，4 ℃，12 000 × g离心10 min。转移上层水相液500 ?滋L到新的离心管，加入500 ?滋L异丙醇，室温静置10 min，4 ℃，12 000 × g离心7 min。弃上清，加入1 mL无RNA酶水配制的75%酒精，振荡混匀，4 ℃，7 500 × g离心5 min。重复酒精洗涤沉淀一遍，弃去酒精，室温干燥5 min，融解RNA于30 ?滋L无RNA酶水中，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA含量，出RT-PCR所需样品量。
1.5 RT-PCR
取总RNA1.5 ?滋g，按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照，进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应：95 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 45 s变性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 45 s延伸，共35个循环，最后一次循环在72 ℃延伸7 min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳，Labwork成像系统采集图像及分析。合成引物序列，MMP-9-上游引物：5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′，下游引物：5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′，扩增产物为362 bp；TIMP-1-上游引物：5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′，下游引物：5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′，扩增产物为340 bp；β-actin-上游引物：5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′，下游引物：5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′，扩增产物为195 bp。
1.6 ELISA测定
收集细胞上清液，4 ℃，3 000 r/min离心10 min，取上清，-80 ℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法，按照说明书步骤进行，测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。
1.7 统计学处理
所有数据均以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，三组间比较用单因素方差分析，两组间比较用LSD-t 检验，应用SPSS 10.0统计分析软件进行统计分析，P< 0.05 为差异有显著性。
2 结 果
2.1 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响
与相同浓度NL组相比，5%、10%、20%AS组MMP-9 mRNA表达均显著性增高（P值均< 0.05）。与相同浓度AS组相比，5%、10%、20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显著性降低（P值分别为0.005、0.041和0.013）。与相同浓度NL组相比，5%、10%SIM组MMP-9 mRNA表达均增高（P值分别为0.034和0.029，表1、图1）。
不同浓度间SIM组MMP-9 mRNA表达差别无统计学意义（F=1.747，P=0.252）。
2.2 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1 mRNA表达的影响
NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1 mRNA表达无显著差异（表2、图2）。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1 mRNA的表达有显著性差异（F= 6.498，P=0.032）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组TIMP-1 mRNA的表达显著性增加（P=0.039、0.014），而10%与20%SIM组之间无显著性差异（P=0.446）。
2.3 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较，10%、20%AS组MMP-9分泌均显著性增加（P=0.007、0.002）；5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.824、0.857、0.658）。与同浓度AS组比较，5%SIM组MMP-9分泌无显著性差异（P=0.427），10%、20%SIM组MMP-9分泌显著性减少（P=0.009、0.001，表3）。
SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显著性差异（F=0.985，P=0.427）。
2.4 辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响
与同浓度NL组比较，AS组TIMP-1分泌均显著性减少（P=0.004、0.044、0.003）；与同浓度NL组比较，5%SIM组TIMP-1分泌减少（P=0.038）。与同浓度AS组比较，10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.017、0.001，表4）。
SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显著性差异（F=6.555，P=0.031）。与5%SIM组相比，10%、20%SIM组 TIMP-1分泌均显著性增加（P=0.038和0.014）。而10%和20%含药血清之间差异无显著性（P=0.456）。
3 讨 论
3. 1 MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性
急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1]，通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上，斑块破裂，继而血小板粘附聚集和血栓形成，引起完全或不完全的血管阻塞，导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主，常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解，导致斑块中胶原含量减少，纤维帽变薄，是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部，此处巨噬细胞可分泌大量MMP，促进纤维帽降解[10]。MMP-9，又称明胶酶B，是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物，目前已发现有4种：TIMP-1～TIMP-4，它们均可与激活的MMP 呈1 ∶ 1结合，从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显著性增多，且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内，与MMP分布部位一致，部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/ TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡，对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12]，MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节，而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药方法观察到，与同浓度NL组相比较，5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显著性增高（P值均< 0.05）。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇，以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质，促进MMP -9的表达。与相同浓度NL组比较，AS组TIMP-1 mRNA表达无显著性差异，但TIMP-1的分泌均显著性减少（P< 0.05），提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加，同时还可使TIMP-1分泌增加（翻译后水平）而表达（mRNA水平）并未增加，具体机制尚不清楚。
3. 2 他汀药与MMP/TIMP
PROVE IT（TIMI-22）研究[13]显示强化他汀可使ACS患者30 d的临床事件减少，在稳定的患者，使临床事件长期降低，但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道，西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9，但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示，与相同浓度AS组相比，5%、10%和20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显著性降低（P值< 0.05）；10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显著性减少（P值均< 0.01）。与相同浓度AS组相比，SIM组TIMP-1 mRNA表达无显著性差异（P >0.05）；但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显著性增加（P值均< 0.01）。与Luan等[14]的报道有所不同，本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临床事件的机制之一。他汀具有多效作用（Pleiotropic effects）[15]，除了调脂作用外，还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌，同时还增加TIMP-1的分泌，从而调节MMP与TIMP之间的平衡，起到稳定斑块的作用。
【】
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