人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建
作者：张志， 黄宗青， 沈琪， 刘洪涛， 邓英太， 李爱东， 周国强， 汪华侨， 何蕴韶
【摘要】 【目的】 克隆健康人苯丙氨酸羟化酶基因全长cDNA序列，构建并鉴定其原核表达质粒pTrcHisB/PAH。【方法】 采用RT-PCR方法从人肝组织中扩增 PAH基因全长cDNA，T/A 克隆到pMD18-T载体中，双酶切后将cDA亚克隆入pTrcHisB载体，构建pTrcHisB/PAH质粒，经限制性内切酶鉴定并测序。【结果】 人PAH基因cDNA正确克隆入pTrcHisB表达载体，与Genebank中PAH基因序列一致。【结论】 成功构建pTrcHisB/PAH表达质粒，为进一步进行研究PAH蛋白表达和重组蛋白活性鉴定奠定基础。
【关键词】 苯丙酮尿症； 苯丙氨酸羟化酶； 克隆； 原核表达质粒
[J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(3):288-291] 苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是神经科常见氨基酸代谢障碍的常染色体隐性遗传病。98%～99%是由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase, PAH）基因突变导致肝脏苯丙氨酸羟化酶活性降低而致病[1]。当前的基因为本病治疗提供了崭新的思路[2]。国外学者已经在PKU小鼠模型上用腺病毒载体转导PAH进行基因治疗获得一定的成功，但是始终未能解决生物安全和如何长期稳定表达等问题[3,4],阻碍了这种方法的临床推广和应用。本研究旨在通过体外原核表达活性PAH蛋白，开发新型PKU基因治疗药物，改进当前PKU治疗单纯依靠饮食控制的现状。我们采用基因工程重组技术从健康人肝细胞中定向克隆出人PAH基因,构建pTrcHisBPAH原核表达质粒并进行鉴定，为以后PAH蛋白的体外表达打下基础，结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要材料和试剂 新鲜肝脏标本来自中山大学附属第一肝胆外科肝血管瘤病人手术;pTrcHisB、TOP10 (Invitrogen), pMD18-T Vector (TaKaRa),Trizol (GIBCO)、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (#1621)、EcoRI、Kpn I (MBI Fermentas), QIA quick Gel Extraction Kit、QIA Spin Miniprep Kit (QIAGene)、T4?鄄DNA Ligase (Invitrogen)。大肠杆菌DH5α为中山大学达安基因中心提供。
1.1.2 主要设备 玻璃匀浆机、高速冷冻离心机、恒温摇床、恒温培养箱、－80 ℃冰箱（日本SANYO公司）、PE9600 PCR扩增仪、ABI3100 Avant DNA测序仪（美国PE公司）。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 GeneBank上登录PAH基因mRNA序列(GI：18765884)，在Primer Premier5.0和 Olig6.0软件设计引物扩增PAH的编码序列(CDS)，5′端设计Kpn Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点加上3个保护碱基。引物由上海生工合成。
1.2.2 目的基因的获得 从人新鲜肝脏标本Trizol法提取总RNA，检测A260和A280值，浓度，－80 ℃保存。取RNA 2 μg采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA(complement DNA)。以PAHcDNA为模板做RT－PCR。反应条件: 93 ℃ 10 min、 93 ℃ 45 s、56 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35个循环后, 72 ℃ 10 min。PCR产物浓缩后在0.8%琼脂糖上电泳（1 377 bp），用QIA quick Gel Extraction Kit割胶纯化， 1％琼脂糖电泳鉴定、拍照、－20 ℃保存。
1.2.3 PCR产物克隆和鉴定 克隆反应体系:纯化的PCR产物4 μL、 pMD18-T Vector 1 μL、Ligation Solution I 5 μL，16 ℃过夜，得到pMD18-T/PAH质粒，转化感受态大肠杆菌 DH5a，涂含氨苄青霉素LB平板，IPTG进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，体外扩增并PCR初筛后菌液抽提pMD18-T/PAH质粒，用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切并测序鉴定。测序正向引物为M-47, 反向为M-48, 中间引物为5′-TGGAATACATGGAGGAAGA-3′。测序在中山大学达安基因中心完成。
1.2.4 原核表达载体 pTrcHisB/PAH 构建和鉴定 质粒pTrcHisB空载体和质粒pMD18-T/PAH分别经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切，割胶回收目的基因片断和空载体。目的基因与空载体pTrcHisB按5∶1的比例混合进行连接反应, 加入Ｔ4连接酶2Ｕ,反应体积为10 μＬ,18 ℃连接过夜。反应液全部转化入感受态TOP10细菌中培养过夜，在含氨苄青霉素LB平板上随机挑取10个单菌落，摇菌培养，PCR初筛后抽提pTrcHisB/PAH质粒，用Kpn１和EcoR１双酶切并全长测序鉴定，测序引物为RT－PCR引物和上述中间引物。
2 结 果
2.1 肝组织总RNA结果
提取总RNA电泳后可见三条带, 说明提取的RNA较完整。所测1、2两个标本的A260 / A280分别为2和1.99，其浓度分别为4.84和2.85 ?滋g/?滋L，RNA纯度符合要求。
2.2 PAH基因CDS序列的RT-PCR结果
本研究设计RT－PCR片段大小为1 377 bp，包含PAH基因的CDS序列1 359 bp。图1中P为RT－PCR产物，片段大小与预期设计基本相符。
2.3 pMD18-T/PAH酶切结果
RT-PCR的片段大小为1 377 bp,pMD18-T的大小为2 692 bp, PMD-18/PAH大小理论上应为1 377+2 692= 4 069 bp。酶切鉴定结果(图2)与设计结果相符。
2.4 pTrcHis/PAH酶切结果
pTrcHisB空质粒大小为4 400 bp,PAH基因CDS的大小为1 359 bp,理论上pTrcHis-PAH的大小为4 400+1 359=5 759 bp,酶切鉴定结果(图3)与设计结果相符。
2.5 pMD18-T/PAH测序结果
测序结果表明pMD18-T/PAH序列与GeneBank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致, pMD18-T/PAH5′端起始密码子(ATG)和3’端终止子(TAA)及两侧KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶的识别序列均完整。
2.6 重组表达质粒测序结果
测序结果表明pTrcHis-PAH质粒序列与GeneBank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致, pTrcHis-PAH质粒（图１）5′端起始密码子(ATG)和3′端终止子(TAA)及两侧KpnI和EcoRI限制性内切酶的识别序列均完整, 序列完全正确，未见框移和突变(图４)。
3 讨 论
PKU是1934年法国医生Folling首次报道。PKU是常染色体隐性遗传病，其致病基因PAH基因已经成功分离、克隆[5]。PAH基因定位于12号染色体(12q22-12q24.1)，大约由1.5 Mb碱基组成。PAH基因是断裂基因，mRNA为2.4 kb，编码区包含13个外显子和12个内含子。mRNA大小为1 353 bp，翻译成含451个氨基酸的酶单体[6,7]。
PKU是由于PAH基因突变导致PAH酶的催化活性减弱或消失引起[1]。迄今全世界已经发现PKU有524多种不同类型的突变（）。1997年后PKU分子遗传学的研究热点逐渐转为PAH基因突变的功能研究，即进入PAH后基因组学研究，我国学者也在这个领域做了大量的工作，发现了很多新的突变[8]。迄今全世界共发现70余种致病突变，导致PAH酶的催化功能减弱或消失，引起体内苯丙氨酸的蓄积致病 [9,10]。
我们于2003年采用荧光PCR技术成功建立经典型PKU的基因诊断方法[11]。鉴于目前国内外研究PKU基因的报道尚少，为了探讨PKU的新型基因治疗方法，弥补PKU治疗的缺陷，本研究采用基因工程技术，根据Genebank中PAHcDNA序列,自行设计一对引物,分别在引物5′端和3′端设计KpnI和EcoRI酶切识别位点,并添加保护碱基,扩增包括目的基因在内的全部序列,PCR产物克隆入pMD18-T载体构建pMD18-T/PAH质粒，KpnI和EcoRI双酶切鉴定后全长测序证实pMD18-T/PAH质粒序列完整、正确，即包含起始密码、终止密码及两端的KpnI和EcoRI识别序列。pMD18-T/PAH质粒双酶解消化，目的基因片段定向克隆入pTrcHisB表达载体，蓝白斑筛选挑白色菌落，PCR初筛后转化入TOP10菌体中扩增，抽提重组质粒，KpnⅠ和EcoRⅠ双酶解鉴定，最后全长测序。测序结果表明我们获得的pTrcHisB/PAH质粒序列与GeneBank上PAH基因cDNA序列(GI:18765884)一致, 且pTrcHis/PAH质粒中5′端起始密码子(ATG)和3′端终止子(TAA)及两侧KpnI和EcoRI限制性内切酶的识别序列均完整, 序列和方向完全正确，未见框移和突变,表达质粒的成功构建为下一步重组蛋白的表达和纯化研究奠定了坚实的基础。目前,该重组质粒的表达及其重组蛋白的活性鉴定研究正在进行之中。
【】
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