镁对大鼠离体缺血再灌注心肌的作用
作者：张君平，杜友爱，郭益民，刘重斌，余立群
【摘要】 目的:观察在缺血再灌注5 min后应用镁剂是否能对离体缺血再灌注心肌起到保护作用。方法:建立Langendorff离体心脏缺血再灌注模型，结扎冠状动脉左前降支，缺血20 min，复灌60 min，高镁组在复灌5 min时应用浓度为2.4 mmol/L、4.8 mmol/L、8.4 mmol/L的高镁K-H液灌注10 min。观察心脏血流动力学指标，实验结束时测心肌匀浆MDA含量，免疫组化检测SOD的含量。结果:①复灌15 min时三个高镁组LVSP、LVDP×HR、LV±dp/dtmax明显低于缺血再灌组。②复灌60 min时三个高镁组各指标与缺血再灌组相比差异无显著性。③三个高镁组MDA含量明显低于缺血再灌组，SOD阳性表达明显高于缺血再灌组。结论:缺血再灌注5 min应用高镁K-H液对缺血再灌注心肌的即时作用表现为抑制心脏的血流动力学，复灌结束测得的MDA含量说明镁对心肌有保护作用，体现为抗脂质氧化作用。
【关键词】 高镁；心肌；缺血再灌注
Abstract: Objective: To investigate the role of high magnesium on rat isolated hearts after 5 min of ischemia/reperfusion. Methods: Cardiac hemodynamics indicators were analyzed with the Langendorff method in rat’s isolated heart. MDA was further determined in the experiment. All isolated hearts were subjected to 20 min of ischemia followed by 60 min of reperfusion. Results: ①The groups of high magnesium, perfused with 2.4 mmol/L, 4.8 mmol/L, 8.4 mmol/L magnesium after 5 min of reperfusion for 10 min, left ventricular systolic pressure, multiplication of left ventricular developed pressure and heart rate, and left ventricular±dp/dtmax were predomintly decreased compared with control group (P<0.05). ②All indicators in the end of reperfusion had no statistical difference compared with the control group. ③The MDA concentration of the high magnesium groups was significantly lower than that of the control group, SOD of the high magnesium groups was significantly higher than that of the control group (P<0.05). Conclusion: Increased magnesium can inhibit myocardium, while it can protect heart from ischemia/reperfusion injury. The cardioprotection may be through anti-lipid-oxidation to decrease MDA concentration.
Key words: high magnesium; myocardium; ischemia/reperfusion
心肌缺血再灌注损伤临床主要表现为再灌注性心律失常、心功能下降和心肌坏死面积扩大等。近年来，镁在心血管疾病中的作用日益受到重视，在体和离体缺血再灌注研究[1-4]说明，在缺血期或再灌注即时应用高镁对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。本实验观察在缺血再灌注5 min后应用镁剂对缺血再灌心肌的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物和试剂 Sprague-Dawley 雄性大鼠（体重200～250 g）40只，由温州医学院实验动物中心提供。MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所，SOD免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。其它试剂均购自温州金山化学试剂仪器公司。
1.2 缺血再灌注模型 参照[5]建立Langendorff离体心脏灌流及缺血再灌注模型。K-H 液成分如下（g/L）：NaCl 6.896、KCl 0.350、KH2PO4 0.163、MgSO4·7H2O 0.296、NaHCO3 2.100、CaCl2 0.278、Glucose 1.982，pH 7.4。整个灌注期间温度保持在（37±0.5）℃，灌注液用95%O2+5%CO2饱和。左心室内的球囊连接压力传感器，后者与MedLab生物信号采集处理系统连接。调节球囊内水量，使左心室舒张末期压维持在4～10 mmHg。平衡灌注20 min 时测定血流动力学指标，作为基础值。
1.3 实验分组 SD大鼠随机分成5组，每组8只。假手术组（S组）冠状动脉左前降支穿线不结扎，维持灌注100 min；缺血再灌注组（C组）平衡20 min，结扎冠状动脉左前降支，缺血20 min后松开，复灌60 min；高镁组分别在再灌注后5 min用镁浓度为2.4 mmol/L（H1组）、4.8 mmol/L（H2组）、8.4 mmol/L（H3组）的K-H液灌注，10 min后换回正常K-H液，其余操作同缺血再灌注组。
1.3 指标测定
1.3.1 心功能测定指标：通过MedLab生物信号采集处理系统获得的数据观察缺血再灌注过程中大鼠心脏在平衡末、复灌15 min、复灌60 min时的心率（HR）、左心室收缩末期压力（LVSP）、左心室舒张末期压力（LVEDP）、左心室压力变化率（LV±dp/dtmax），左心室做功（LVDP×HR）；在上述时点收集冠脉流出液，计时1 min，测冠脉流出量（CF）。
1.3.2 心肌MDA的测定（TBA法）：实验结束后，取结扎点以下的左心室游离心肌组织，在4 ℃的生理盐水冰浴中制成10%心肌匀浆，离心(3000 r/min，15 min)，取上清液，按照试剂盒说明测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。
1.3.3 心肌SOD免疫组化检测（SABC法）：实验结束后，取结扎点以下的左心室游离心肌组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。常规脱蜡，严格按照试剂盒说明书步骤，检测心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）。棕黄色显色为SOD阳性表达。用ImageProPlus（IPP）软件进行分析，测定阳性染色面积（AREA）和累计光密度（IOD），计算阳性染色面积在组织中所占的比例，记作AREA%=阳性染色面积/图片中组织的面积。
1.4 统计学处理方法 用SPSS 10.0软件进行统计学处理，多组间比较采用方差分析，组间均数的两两比较采用LSD法。
2 结果
2.1 血流动力学指标 平衡末三个高镁组与C组比较，各指标差异均无显著性（表1）。复灌15 min（即应用高镁10 min时），与C组相比，三个不同浓度的高镁组LVSP、LVDP×HR及LV±dp/dtmax均显著下降，CF无明显变化（表2）。复灌结束时上述各指标各组间差异均无显著性，如表3。
2.2 MDA及SOD 高镁对心肌组织中的MDA和SOD含量的影响，见表4。实验结果显示，相比于C组，三个高镁组的SOD表达明显增强，MDA含量明显减少，差异均有显著性。
3 讨论
镁是人体内的重要阳离子之一，其细胞内含量仅次于钾。镁是体内300多种酶系的辅助因子或激动剂，参与体内许多重要代谢过程，几乎与生命活动的各个环节有关。尽管镁制剂在一些心血管疾病上的有益作用是肯定的,但其作为细胞保护剂应用于再灌注损伤是否能发挥良好的心肌保护作用还存在争议[6]。尤其是因为使用时间的不一致，致使其发挥保护作用受到一定的局限[7]。
研究表明，较高浓度（2.4 mmol/L）的镁能改善收缩功能和冠脉血流；瞬时的更高浓度（15 mmol/L）的镁和钙（3 mmol/L）其保护作用更显著[8]。本实验在复灌5 min后才换用含不同浓度高镁的K-H液，结果发现应用10 min高镁对心脏产生明显的即时抑制作用，但在复灌结束时三个高镁组对心肌血流动力学的影响并不明显，可恢复到与缺血再灌组相同的水平。
MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用产生的一种脂质过氧化物。测定MDA的量可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。而SOD能清除氧自由基，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。
免疫组化结果显示，SOD的表达在三个高镁组均呈阳性，与缺血再灌注组相比差异有显著性；同时，三个不同浓度的高镁组心肌组织匀浆中MDA的含量均显著低于缺血再灌组，证明高镁可以通过清除氧自由基，抗脂质氧化作用实现其对心肌的保护作用。然而高镁对缺血再灌注心肌的保护作用并未随镁浓度的升高而不断增强，体现在无论是MDA的减少还是SOD表达的增强均在H1与H2组之间差异有显著性，H1与H3，H2与H3之间差异无显著性。故推测K-H液中镁离子浓度为4.8 mmol/L时其保护作用最强。
Bershon等[9]认为只有在缺血损伤产生之前利用高镁的抑制心脏做功、降低能量消耗等负性肌力作用才能对心肌起到一定的保护作用，帮助缺血心肌功能恢复。也有研究发现迅速升高的血镁浓度会对实验动物产生致死毒性[10]。本实验在复灌5 min后应用高镁K-H液10 min，证实高镁对心肌的抑制作用和保护作用同时存在，复灌60 min实验结束时表现在血流动力学上的两种作用互相抵消，而以MDA结果来看其保护作用又非常明显。导致这种结果的可能原因是因为氧自由基在正常情况下可以被内源性自由基清除剂所清除，但当组织细胞缺血缺氧时，其清除系统功能降低或丧失，而生成系统活性增强，一旦恢复组织血液供应和氧供时氧自由基便会大量产生，急剧“堆积”[11]。这一过程主要集中在缺血期和复灌早期，当心肌损伤已经造成时再应用高镁只能减少以后的氧自由基的产生，而无法改变其抑制房室和心室内传导、降低心肌兴奋性、从而引起传导阻滞和心动过缓的负性作用，所以出现SOD表达增强，MDA含量减少，而血流动力学指标无明显变化的结果。
据此可以认为心肌缺血再灌注之后应用高镁对心肌仍有保护作用，但用镁的浓度与缺血前预防性补镁有所差别，缺血再灌注损伤已经造成时用镁的浓度不能过高，否则其抑制作用会将保护作用掩盖掉而达不到正面效果。应用高镁的上限浓度及其对心肌作用的两面性的作用机制有待进一步研究。
【】
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