多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226上清液抑制成骨细胞早期分化

【摘要】  目的:探讨多发性骨髓瘤细胞上清液在体外抑制成骨祖细胞早期分化的现象。方法:以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226上清加入到成骨祖细胞MC3T3-E1 rBMP2诱导分化体系中培养6 d后，计数碱性磷酸酶染色结节并以RT-PCR方法测定碱性磷酸酶和骨钙素mRNA水平。结果:MC3T3-E1诱导组和30%的骨髓瘤上清干预组的染色结节计数分别为（20.33±5.16）/低倍视野和（13.66±2.80）/低倍视野（P<0.05）。此外，30%上清干预组的碱性磷酸酶mRNA水平低于诱导组（P<0.05），而骨钙素mRNA水平差异无显著性（P>0.05)。结论:多发性骨髓瘤细胞RPMI8226上清液能够抑制rBMP2诱导的成骨祖细胞MC3T3-E1早期分化过程。

【关键词】  多发性骨髓瘤 成骨祖细胞 成骨分化

    Abstract:  Objective: To investigate the effect of supernatant from Mutiple myeloma cells RPMI8226 on the early stage of osteoblast differentiation in vitro. Methods: The supernatant from Mutiple myeloma cells RPMI8226 was added into the system of the osteoblast differentiation which induced by rBMP2. After 6 days, osteoblast was collected to identify ALP staining nodule counting and mRNA of ALP and OC with RT-PCR. Results: The ALP staining nodule counting was（13.66±2.80）/L-visualis in supernatant intervention group and it was, （20.33±5.16）/L-visualis in control group.The level of ALP mRNA was lower in supernatant intervention group than that of control group（P<0.05）. But the level of OcmRNA in both group was indiscrimination（P>0.05). Conclusion: The supernatant from Mutiple myeloma cells RPMI8226 inhibits the the early stage of osteoblast MC3T3-E1 differentiation which induced by rBMP2.

    Key words:   Mutiple myeloma; osteoblast; osteoblast differentiation

    多发性骨髓瘤是一种常见血液系统肿瘤多发性疾病，主要病理改变是由于浆细胞克隆性恶性增生，并大量分泌蛋白和小分子因子，破坏了破骨细胞和成骨细胞在正常组织中形成的平衡状态，从而引起骨质破坏[1，2]。75%多发性骨髓瘤患者伴有骨痛、骨质疏松、骨质破坏、病理性骨折或高钙血症等[3]。目前国内外对多发性骨髓瘤的分子机制研究集中于破骨细胞的激活机制，而成骨细胞抑制的机制不明。我们采用多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226上清液与成骨祖细胞株MC3T3-E1相互作用培养后，以碱性磷酸酶结节染色和RT-PCR法检测碱性磷酸酶和骨钙素mRNA水平来揭示在体外骨髓瘤细胞上清液对成骨细胞分化成熟过程的影响。

    1  材料和方法

    1.1  材料  人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226，浙江大学医学院血液研究所金洁教授惠赠（ATCC编号:CCL-155）。鼠胚成骨祖细胞MC3T3-E1购于武汉大学细胞保藏中心(CCTCC 编号:CRL-2593)。DMEM-低糖培养液购于GIBCO公司。碱性磷酸酶染色试剂盒购于上海虹桥医用试剂公司。Trizol购于Invitrogen。RT kit、PCR mix购于Fermantas公司。PCR引物合成于上海生工。rBMP2购于R&D公司。

    1.2  方法 

    1.2.1  成骨祖细胞株MC3T3-E1的培养和诱导分化：培养成骨祖细胞株MC3T3-E1用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培养基的完全培养基并在37 ℃、5% CO2的条件下培养，待细胞长至90%左右融合时传代于培养六孔板。诱导分化：取细胞状态良好的融合细胞1:3传代，取MC3T3-E1细胞5×104个接种于六孔板中，3 h后待细胞完全贴壁后吸取上清后，加入3 ml含50 ng/mL rBMP2的上述培养体系，3 d后换液，培养6 d后收获细胞。

    1.2.2  多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的培养和上清收集：多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226以完全培养基在37 ℃、5% CO2的条件下培养，细胞悬浮，取2×105/ml细胞接种于75 cm2培养瓶培养3 d，取细胞悬液置于3管15 ml离心管，1000 r/min，5 min离心后用孔径为0.22μm的无菌过滤器过滤，置于无菌离心管中于-70 ℃低温冰箱保存。

    1.2.3  多发性骨髓瘤细胞上清对成骨祖细胞分化的影响：将诱导分化培养的成骨祖细胞分为①空白对照组：予完全培养基。②诱导分化组：予含50 ng/ml rBMP2的完全培养基。③20%上清干预组：予含20%骨髓瘤细胞上清、50 ng/ml rBMP2的完全培养基。④30%上清干预组：予含30%骨髓瘤细胞上清、50 ng/ml rBMP2的完全培养基。取MC3T3-E1细胞5×104个于六孔板中培养，3 d后换液，6 d后收获细胞。

    1.2.4  碱性磷酸酶染色检测：取培养好的细胞，弃上清，按上海虹桥医用试剂公司碱性磷酸酶试剂盒操作说明染色，10×10倍倒置显微镜下双盲法计数染色结节，重复实验3次。

    1.2.5  RT-PCR测定碱性磷酸酶（ALP)和骨钙素（OC)mRNA水平：用1mlTrizol提取细胞总RNA，吸取1μg总RNA，加1μl oligo dT118，孵育70 ℃ 5 min，4μl 5x reaction buffer，0.25μl RNA酶抑制剂，0.75μl DEPC水，2μl 10mM dNTP mix，PCR仪上37 ℃ 5 min，再加逆转录酶1μl后42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min逆转录。取0.2 ml PCR管置冰上，加入10μl 2×PCR master mix，8μl去核酸水，加入1μl cDNA，1μl引物，引物序列分别为：ALP Sense 5'AAC CCA GAC ACA AGC ATT CC3'，Antisense 5'GAG ACA TTT TCC CGT TCA CC3'；OC Sense 5'GCA GCT TGG TGC ACA CCT AG3'，Antisense 5'GGA GCT GCT GTG ACA TCC ATA C3'；GAPDH Sense 5'GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT3'，Antisense 5'TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG3'。PCR仪上94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，（ALP)58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环。（OC)60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 30个循环。（GAPDH)58 ℃退火，72 ℃延伸30 s，28个循环；72 ℃延伸10 min。1.5%琼脂糖电泳鉴定,ImageMaster UDS图像摄像分析仪观察记录图，quantity one 凝胶分析软件取目的条带与GAPDH基因灰度的比值进行条带分析，重复实验3次。

    1.3  统计学处理方法  实验数据均以均数±标准差（±s)表示，以SPSS11.5为统计软件，两两比较采用单因素方差分析。

    2  结果

    2.1  细胞形态学，碱性磷酸酶染色结果  成骨祖细胞株MC3T3-E1培养6 d后，基本铺满底部，呈梭形，长条带状，并形成集落。诱导组细胞的形态及生长和空白组无明显差异，上清干预组细胞形态变粗短，细胞内颗粒增多，偶见空泡，生长明显缓慢。碱性磷酸酶染色结果（如图1）：空白对照组细胞基本无结节染色，诱导组出现许多紫红色结节，呈阳性反应，而干预组中细胞紫红色染色结节减少，细胞数量减少，30%上清干预组比20%上清干预组更为明显。

    2.2  碱性磷酸酶染色结节计数和骨钙素（OC)、碱性磷酸酶（ALP)RT-PCR结果  30% RPMI8226细胞株上清干预组与诱导组比较，碱性磷酸酶染色结节计数P<0.05，差异有显著性。而20%上清干预组与诱导组比较P=0.66，差异无显著性。将四组中目的条带与GAPDH基因的比值分别作单因素方差分析，结果：OC/GAPDH，空白对照组与诱导组比较P<0.05，诱导组与两个干预组比较，差异均无显著性。而ALP/GAPDH，诱导组分别与空白对照组、20%上清干预组和30%上清干预组比较，P均小于0.05，差异均有显著性，详见表1，图2～3。

    3  讨论

    75%多发性骨髓瘤患者伴有骨痛、骨质疏松、骨质破坏、病理性骨折或高钙血症等，骨质破坏成为主要的死因[3]。目前，国内外有关多发性骨髓瘤的骨质损害的机制研究中，对破骨细胞激活机制研究比较多。研究发现，多发性骨髓瘤细胞能大量分泌某些小分子物质或蛋白质，刺激一种被称为破骨细胞生长因子(Receptor Activator of Nuclear Factor-B Ligand，简称RANKL)的化学物质，使破骨细胞过度激活[4-5]。但是，有研究表明，单用具有阻断骨质重吸收功能的焦二磷酸盐并不能使骨质损害的病情彻底改善[6]，成骨抑制机制在骨损害中亦发挥作用。目前国内外涉及多发性骨髓瘤抑制成骨细胞的活性的研究很少，有研究发现，DKK-1、IL-3、SFRP对成骨过程起调控作用，但具体机制仍不明[7-9]。成骨细胞体外培养模型的观察显示，成骨祖细胞分化分为三个阶段:细胞增殖阶段、骨基质成熟阶段和骨基质矿化阶段[10]。在骨基质成熟阶段，ALP基因表达水平达最高峰。在骨基质矿化阶段，OC基因表达较前明显增加[11]。MC3T3-E1细胞株是鼠胚成骨祖细胞，具有成骨细胞表型特征,它能代表分化早期阶段的成骨细胞，表达低浓度的ALP[8,10]。BMP2是存在于骨基质中的酸性蛋白质，外源性的BMP2在鼠成骨过程中可以刺激I型胶原和ALP等mRNA的表达，从而刺激骨形成[12-13]。  

    在本实验中，我们以BMP2诱导成骨祖细胞MC3T3-E1，能够明显增加ALP和OC mRNA和ALP染色结节水平，BMP2可以诱导成骨祖细胞向成骨细胞分化。其次，高浓度组30%的骨髓瘤细胞上清与成骨祖细胞作用6 d，该条件下成骨祖细胞碱性磷酸酶的mRNA及染色结节等均出现显著下降，说明多发性骨髓瘤细胞分泌的人鼠同源的可溶性小分子因子可以通过间接的作用抑制成骨分化中骨基质成熟的早期过程。而代表骨质矿化指标的骨钙素mRNA在此条件下并无改变，与以往国外报道的资料一致，但骨质矿化需要9～12 d以上时间[11]，延长干预时间可能会出现另外的结果。我们的实验同时说明，骨髓瘤细胞的上清液中含有骨髓瘤细胞分泌的各种小分子物质或蛋白质，能够影响成骨分化的作用，这种抑制作用并不依赖于骨髓瘤细胞与成骨细胞的互相接触。再次，低浓度组20%的骨髓瘤细胞上清与成骨祖细胞作用6 d干预诱导成骨过程，碱性磷酸酶染色结节并无减少，但是这种浓度下碱性磷酸酶的mRNA已有显著性下降，我们分析是由于该条件下mRNA合成下降但蛋白水平还未表现出明显的差异，由此我们可以推测，骨髓瘤上清抑制成骨的程度可能与上清液中可溶性物质的浓度有关。  

    本实验阐明，多发性骨髓瘤细胞RPMI8226上清液能够抑制rBMP2诱导的成骨祖细胞MC3T3-E1早期分化过程，而且本实验建立了多发性骨髓瘤细胞抑制早期成骨分化的细胞模型，为进一步研究骨髓瘤抑制成骨的基因机制奠定了基础。

【】
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