引物浓度与退火温度不当导致巢式PCR非特异性扩增

【摘要】  目的 探索巢式PCR非特异性扩增的产生原因及消除方法。方法 以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HBV）S gene为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察并分析实验结果。结果 降低引物浓度或提高退火温度均可消除巢式PCR的非特异性扩增，但提高退火温度有可能影响反应的扩增效率，导致产物量下降甚至得不到产物。结论 巢式PCR发生非特异性扩增时，可以提高退火温度或降低引物浓度对反应体系进行优化。

【关键词】  巢式PCR HBV S gene 非特异性扩增

    Abstract：Objective To find the reason of causing nonspecific amplication in nested PCR and abate it.Methods To amplify HBV S gene by Nested PCR in different primer concentration and annealing temperature and observe the result.Results Both elevating annealing temperature and decreasing primer concentration can abate nonspecific amplication in nested PCR.But elevating annealing temperature may affect the amplifying effciency that result to decrease or eliminate the PCR products.Conclusion When nonspecific amplication happened in nested PCR,both elevating annealing temperature and decreasing primer concentration can optimize the reaction system.

    Key words:nested PCR;HBV S gene;nonspecific amplication

     常规PCR扩增技术应用一对引物扩增目的基因片段，灵敏度和特异性有时达不到实验者的要求。Mullis［1］在常规PCR基础上建立了巢式PCR（nested PCR）。巢式PCR采用两对PCR引物，进行两轮PCR扩增。使用外侧引物进行第1轮PCR，得到的扩增产物作为第2轮PCR的模板，再使用内侧引物进行第2轮PCR扩增目的片段［2］。

    无论是常规PCR还是巢式PCR，实验者经常会受到非特异性扩增的困扰。从电泳结果上看非特异性扩增表现为与目的片段长度不符的DNA条带或大片弥散状拖带。根据发生机制，非特异性扩增可大致分为两类：第一类非特异性扩增是由引物与模板的非特异性结合引起的，第二类非特异性扩增是由引物与引物之间发生连接引起的。

    扩增病毒基因组目的片段时，由于病毒基因组内同源性高，使用常规PCR易发生第一类非特异性扩增，即扩增产物为基因组内其他同源片段，而非目的片段。巢式PCR以第1轮PCR的产物作为第2轮PCR的模板进行两轮PCR扩增，从模板方面保证了片段的特异性，降低了第一类非特异性扩增的发生机率。并且由于病毒基因组的含量一般都较低，使用常规PCR扩增得到的产物量经常不能满足后续实验的需要，而使用巢式PCR，可通过两轮PCR扩增显著提高产物量，从而达到后续实验的要求［3］。但另一方面，连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增，特别在第2轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，因而增加了发生第二类非特异性扩增的机率，对后续实验造成严重干扰。

    以巢式PCR扩增乙型肝炎病毒（HBV）S gene［4,5］为模型，分别使用不同退火温度组合与不同引物浓度组合进行巢式PCR扩增，观察它们对非特异性扩增的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    HBV感染者血清由成都医学院第一附属感染科提供。

    1.2  主要试剂

    小量病毒DNA提取试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司；Taq酶购自MBI公司；外侧引物PreS2：5'-GGGACACCATATTCTTGG-3'与S1R：5'-TTAGGGTTTAAATGTATACCCA-3'及内侧引物YS1：5'-GCGGGGTTTTTCTTGTTGA-3'与YS2：5'-GGGACTCAAGATGTTG TACAG-3'［5,6］由上海生工合成；电泳级琼脂糖购自西班牙BIOSCIENCE公司；DNA标准品DL2000购自Takara公司。

    1.3  仪器

    BioRad PCR扩增仪PTC-200；BioRad电泳及凝胶成像系统。

    1.4  方法

    1.4.1  HBV DNA提取  采用小量病毒DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，以10个HBV感染者血清为材料提取HBV DNA。

    1.4.2  使用不同退火温度组合巢式PCR扩增HBV S gene  第1轮PCR反应体积为25 μl，反应体系为：1号感染者HBV DNA 2 μl，外侧引物浓度为0.2 μmol/L，Mg2＋浓度为3 mmol/L，dNTP浓度为0.2 mmol/L，Taq酶1U；反应条件为：首先94℃预变性3 min，然后94℃变性45 s，5个退火温度分别复性45 s，72℃延伸90 s，共循环30次，最后72℃再延伸5 min。取第1轮扩增产物2 μl，再用内侧引物进行第2轮PCR扩增，其他反应体系同第1轮；使用4个退火温度分别复性45 s，其他反应条件同第1轮。使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察不同退火温度组合对巢式PCR非特异性扩增的影响。

    1.4.3  提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响提高两轮的退火温度巢式PCR分别扩增10个HBV感染者的HBV S基因，其他反应体系和反应条件不变。最后使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响。

    1.4.4  使用不同引物浓度组合巢式PCR扩增HBV S基因  第1轮PCR分别使用7个外侧引物浓度在60℃退火，其他条件反应体系和条件不变。分别取第1轮扩增产物2 μl，再用浓度为0.2 μmol/L的内侧引物在62℃退火进行第2轮PCR扩增，其他反应体系与条件不变。再取浓度为0.2 μmol/L的外侧引物扩增产物，使用7个内侧引物浓度进行第2轮PCR扩增，其他反应条件同上。使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察不同引物浓度组合对巢式PCR非特异性扩增的影响。

    1.4.5  降低引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响

    降低外侧引物浓度巢式PCR分别扩增10个HBV感染者的HBV S基因，其他反应体系和反应条件不变。最后使用1％琼脂糖凝胶电泳巢式PCR产物。观察降低外侧引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响。注：以上所有PCR反应的阴性对照均以无菌水为模板。

    2  结果与分析

    2.1  退火温度影响巢式PCR非特异性扩增

    第1轮PCR反应使用5个退火温度：60.3℃、61.7℃、64.3℃、67.5℃与69.3℃，取每个退火温度下得到的产物为模板再使用4个退火温度：61.7℃、64.3℃、67.5℃与69.3℃进行第2轮PCR扩增。电泳结果（图1）表明：第1轮PCR的退火温度在64℃以上或第2轮PCR退火温度在69℃以上就得不到PCR产物了；当第1轮PCR的退火温度在61.7℃时， 585bp目的片段上方的大片弥散状非特异性扩增随第2轮PCR退火温度递增而逐渐降低直至消除，提示提高退火温度能减少非特异性扩增。

    2.2  提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响

    将2轮退火温度分别提高至62℃和65℃，并以60℃和62℃做对照，巢式PCR扩增10个感染者HBV S基因，观察提高退火温度对巢式PCR扩增效率的影响。电泳结果（图2）表明：提高退火温度虽能消除非特异性扩增，但同时影响了巢式PCR扩增效率导致产物量下降甚至得不到产物。图1  退火温度影响巢式PCR非特异性扩增

    2.3  引物浓度影响巢式PCR非特异性扩增

    根据图1、2，无模板的阴性对照经过2轮PCR扩增也发生了非特异性扩增且比加入了模板时更明显，提示非特异性扩增属第二类非特异性扩增。于是，固定内侧引物浓度为0.2 μmol/L，使用7种外侧引物浓度：0.2 μmol/L、0.1 μmol/L、0.05 μmol/L、0.025 μmol/L、0.0125 μmol/L、0.002 μmol/L和0.000 2 μmol/L巢式PCR扩增HBV S gene；再固定外侧引物浓度为0.2 μmol/L，使用相同的7种内侧引物浓度巢式PCR扩增HBV S gene.两组电泳结果（图3）表明：改变内侧引物浓度不能减少非特异性扩增，但降低外侧引物浓度，非特异性扩增也随之减少并直至消除。所以，引起该模型非特异性扩增的原因是：第1轮PCR反应时外侧引物发生了自连接，并在第2轮PCR反应进行了指数倍扩增，造成了达到电泳检测水平的非特异性扩增。

    2.4  降低外侧引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响

    将外侧引物浓度降低至0.025 μmol/L并以外侧引物浓度为0.2 μmol/L为对照巢式PCR扩增10个感染者HBV S基因，观察降低外侧引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响。电泳结果（图4）表明：降低外侧引物浓度能在不影响巢式PCR的扩增效率的同时消除该模型的非特异性扩增。

    所有造成常规PCR非特异性扩增的实验因素均可能同样影响于巢式PCR，如dNTP浓度过高、Mg2+浓度过高、引物浓度过高、退火温度过低、循环次数过多或酶的质量差、量过多［6］等等。这些因素可能单独造成非特异性扩增，也可能通过相互作用造成非特异性扩增。某些因素对常规PCR影响不明显，但在巢式PCR中却可能成为重要影响因素。

    提高退火温度能降低引物与模板间的非特异性结合，也能抑制引物间的自连接，对两类非特异性扩增均有减少的作用。但有时过高的退火温度会影响引物与目的片段的匹配，从而降低PCR反应扩增效率导致产物量下降甚至得不到产物。

    图4  降低外侧引物浓度对巢式PCR扩增效率的影响

    1～10:使用内外侧引物浓度均为0.2μmol/L巢式PCR扩增1～10号感染者HBV S基因产物;

    21～30:使用外侧引物浓度0.025μmol/L和内侧引物浓度0.2μmol/L巢式PCR扩增1～10号感染者HBV S基因产物;DL2000:DNA Marker;－:阴性对照

    Fig.4  Decreasing primer concentration affects amplifying effciency in nested PCR

    1～10:The products of amplifying 1～10# infected persons HBV S gene by nested PCR in primer concentration that is 0.2uM;21～30:The products of amplifying 1～10# infected persons HBV S gene by nested PCR in primer concentration that is 0.025uM and 0.2uM;DL2000:DNA Marker;－:negtive control

    在常规PCR中为了保证PCR扩增效率，引物浓度通常都是过量的。过量的引物在1轮大约30个循环的PCR扩增后，有可能发生自连接出现第二类非特异性扩增，但只要扩增量没有达到电泳检测水平，不会对后续实验造成严重影响。但在巢式PCR扩增中，第1轮PCR扩增后出现的非特异性扩增和过量的外侧引物均会带入第2轮PCR反应再扩增大约30个循环。使得原本电泳检测不到的非特异性扩增被指数倍地放大到电泳检测水平进而影响后续实验。在巢式PCR中若外侧引物与内侧引物在第2轮PCR时发生连接也会造成第二类非特异性扩增。当然内侧引物的自连接有时也是引起第二类非特异性扩增的原因。为了找到巢式PCR出现第二类非特异性扩增是由外侧或内侧引物单独引起的还是它们相互作用引起的，应分别固定内、外侧引物的浓度，再设置另一种引物为不同浓度分别进行巢式PCR，找出原因并采取相应的策略抑制非特异性扩增的出现。

    在优化巢式PCR的过程中，设立无模板阴性对照是区别第一类和第二类非特异性扩增的重要方法。我们之所以将本文模型中发生的非特异性扩增定性为第二类非特异性扩增，主要是通过观察阴性对照的电泳结果。阴性对照的反应体系中没有加入模板，但仍然出现了非特异性扩增，提示非特异性扩增属第二类非特异性扩增；未加入模板时非特异性扩增反而比加入了模板时更明显，则是由于PCR反应体系中加入的模板会消耗部分引物，导致引物间连接造成的非特异性扩增减少。由此可见，在巢式PCR时设立无模板阴性对照，不仅可以监测模板、试剂或操作过程中是否存在污染，还可以帮助我们分析非特异性扩增的原因。

【】
  ［1］Mullis KB.Specific Synthesis of DNA in Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction［J］.M ethods in Enzymol,1987,155:355-360.

［2］Porto-Jordan K.Nested Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Cytomegalovirus Overcomes False Positive Caused by Contamination with Fragment DNA［J］.J Med Virol,1990,30:85-89.

［3］Rabodonirina M,Cotte L,Boibieux A,et al.Detection of Pneumocystis Carinii DNA in Blood Specimens from Human Immunodeficiency virus-infected Patients by Nested PCR［J］.J Clin Microbiol,2000,37(1):127-31.

［4］阎丽,候金林,郭亚兵,等.乙型肝炎病毒基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立［J］.中华传染病杂志,2001,8(4):224-228.

［5］Zeng G B,Wen S J,Wang Z H,et al.A Novel Hepatitis B Virus Genotyping System by Using Restriction Fragment Length Polymorphism Patterns of S Gene Amplicons［J］.World J Gastroenterol,2006,10(21):3 132-3 136.

［6］萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南［M］.第四版.北京:出版社,2002,304-315.