心肌ｅＮＯＳ表达和ＮＯ的改变对糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的影响

【摘要】  测定不同周期链脲佐菌素（ＳＴＺ）诱导糖尿病大鼠心肌ｅＮＯＳ表达、ＮＯ变化及其对缺血／再灌注（Ｉ／Ｒ）损伤的影响。 【方法】 阻断和开放左冠状动脉前降支建立大鼠急性心肌 Ｉ／Ｒ 模型，用ＴＴＣ 染色，测定大鼠心肌 Ｉ／Ｒ 后梗死面积；免疫印迹分析测定心肌ｅＮＯＳ表达；形态测定（Ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ）法测定硝基酪氨酸（Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ＮＴ）的水平；用硝酸还原酶法测定ＮＯ含量。【结果】 在 ＳＴＺ 处理后２周，糖尿病组（２ＷＤ）心肌梗死面积比相应周期对照组（２ＷＣ）明显缩小，ＳＴＺ 处理后１６周（１６ＷＤ），梗死面积比相应对照组（１６ＷＣ）增加；内皮一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）在心肌的表达在 ２ＷＤ 比 ２ＷＣ 组增加３４％， 然而在 １６ＷＤ 比 １６ＷＣ 明显减少；超氧亚硝酸根离子（Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ，ＯＮＯＯ-）生成的标志性产物硝基酪氨酸 （ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ，ＮＴ） 在 ２ＷＤ 组中较 ２ＷＣ 组低约４９％，但在 １６ＷＤ 组中较 １６ＷＣ 组显著增加；血一氧化氮（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）水平 ２ＷＤ 组中较 ２ＷＣ 组增高， 但是１６ＷＤ 组较 １６ＷＣ 组显著减少。【结论】 ＳＴＺ 诱导糖尿病早期、晚期对心肌 Ｉ／Ｒ 损伤呈现相反的作用。这可能是由于早、晚期糖尿病相反的心肌 ｅＮＯＳ 表达及 ＮＯ 改变而引起的。

【关键词】  糖尿病 心肌 缺血 再灌注 内皮一氧化氮合酶 一氧化氮 硝基酪氨酸

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ-ｔｅｒｍ ＳＴＺ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ （Ｉ／Ｒ） ｉｎｊｕｒｙ ｏｆ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ａｎｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｉｆ Ｉ／Ｒ ｉｎｊｕｒｙ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｉａｂｅｔｅｓ-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ（ＮＯ） Ｌｅｖｅｌｓ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 Ｔｈｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉ／Ｒ ｉｎｊｕｒｙ ｗｅｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ （ＬＤＣＡ） ｏｆ ｒａｔｓ． Ｓｉｚｅ ｏｆ Ｉ／Ｒ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｆａｒｃｔ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ （ＴＴＣ） ｓｔａｉｎｉｎｇ； ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ； Ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ； ＮＯ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ． 【Ｒｅｓｕｌｔ】 Ｔｗｏ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ＳＴＺ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ２ ｗｅｅｋｓ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｅａｒｔｓ（２ＷＤ） ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ-ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （２ＷＣ）； Ｗｈｅｒｅａｓ ａｆｔｅｒ １６ ｗｅｅｋｓ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ （１６ＷＤ）， ｔｈｅ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｈｅａｒｔｓ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １６ＷＣ ｇｒｏｕｐ． ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ２ＷＤ ｇｒｏｕｐ ｂｙ ３４％ ｏｖｅｒ ２ＷＣ ｖａｌｕｅｓ； ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ １６ＷＤ ｏｖｅｒ １６ＷＣ ｇｒｏｕｐｓ． Ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ｗａｓ ４９％ ｌｏｗｅｒ ｉｎ ２ＷＤ ｈｅａｒｔｓ， ｂｕｔ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ １６ＷＤ ｇｒｏｕｐ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｓ． Ｐｌａｓｍａ ＮＯ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ２ＷＤ ｒａｔｓ； ｗｈｅｒｅａｓ ＮＯ ｌｅｖｅｌｓ ａｒｅ ｍａｒｋｅｄｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ １６ＷＤ ｇｒｏｕｐ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ-ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｓ． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】  Ｓｈｏｒｔ- ａｎｄ ｌｏｎｇ-ｔｅｒｍ ＳＴＺ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｅｘｅｒｔ ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｉ／Ｒ ｉｎｊｕｒｙ， ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｔｒａｄｉｃｔｏｒｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｍａｙ ｄｅｐｅｎｄ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅＮＯＳ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ＮＯ ｌｅｖｅｌｓ．

　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｉａｂｅｔｅｓ； Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ； Ｉｓｃｈｅｍｉａ／Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ； ｅＮＯＳ； ＮＯ； ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ

　　链脲佐菌素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ） 诱导的糖尿病动物模型在心肌缺血／再灌注（ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，Ｉ／Ｒ）损伤的实验研究呈现出矛盾的结果，包括减轻或增加心肌 Ｉ／Ｒ 损伤［１］。引人注意的是Ｉ／Ｒ 实验时的心肌保护作用，类似于缺血预适应（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ，ＩＰＣ）反应，其保护机理仍未完全明了。研究发现，一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）是血管内皮细胞生存和心肌保护因子，具有抑制细胞凋亡的作用［２，３］，摄入 ＮＯ 供体可减轻 Ｉ／Ｒ 损伤。ＮＯ由内皮一氧化氮合酶（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ＮＯ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ，ｅＮＯＳ）催化Ｌ-精氨酸（Ｌ-ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｌ-Ａｒｇ）合成。缺血再灌注时，超氧阴离子（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ，Ｏ２－·）快速形成［１］，并与ＮＯ反应形成超氧亚硝酸根离子（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ，ＯＮＯＯ－），ＯＮＯＯ－能硝基化酪胺酸蛋白质残基产生硝基酪胺酸（ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，ＮＴ），ＮＴ具细胞毒性，可致细胞死亡。目前，ＳＴＺ诱导糖尿病时ｅＮＯＳ、ＮＯ 和ＯＮＯＯ－新陈代谢的改变及其对心肌 Ｉ／Ｒ 损伤影响尚未完全明了。本实验测定不同时期 ＳＴＺ 诱导糖尿病心肌 ｅＮＯＳ 表达、ＮＴ水平、血浆 ＮＯ 水平及其对 Ｉ／Ｒ 损伤的影响，以期对部分机制作进一步探索。

　　１ 材料和方法

　　１．１ 实验动物与分组

　　健康雄性 Ｓｐｒａｇｕｅ-Ｄａｗｌｅｙ 大鼠（美国Ｈａｒｌａｎ公司）平均体质量约２５０ ｇ 随机分为８组：２周和１６周的 ＳＴＺ 处理组（２ＷＤ和１６ＷＤ）；２周和１６周的ＳＴＺ＋Ｉ／Ｒ（２ＷＤ＋Ｉ／Ｒ和１６ＷＤ＋Ｉ／Ｒ）组，及时间相对应的对照组（２ＷＣ，１６ ＷＣ，２ＷＣ＋Ｉ／Ｒ 和１６ ＷＣ＋Ｉ／Ｒ）；２周组１１只大鼠，１６周组８只大鼠。糖尿病是通过尾静脉注射含 ＳＴＺ （美国Ｓｉｇｍａ公司，５５ ｍｇ／ｋｇ）的柠檬酸缓冲液（０．０１ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ４．５）诱导而成。对照组单独注射等量柠檬酸缓冲液。ＳＴＺ 注射后３ ｄ及 Ｉ／Ｒ 实验前收集尿样、血样测试尿糖和血糖。血糖超过２２ ｍｍｏｌ／Ｌ，尿糖阳性者，归为糖尿病组。为避免酮症酸中毒，糖尿病组ＳＴＺ处理后一周大鼠开始皮下注射胰岛素２ Ｕ／ｄ［４］。该剂量胰岛素仅为预防酮症酸中毒， 注射胰岛素后糖尿病组血糖仍保持在２２ ｍｍｏｌ／Ｌ以上。

　　１．２  急性心肌局部缺血和再灌注的模型

　　ｋｅｔａｍｉｎｅ ＨＣｌ（１００ ｍｇ／ｋｇ） 和 ｘｙｌａｚｉｎｅ（１０ ｍｇ／ｋｇ） 混合腹腔注射麻醉。右颈静脉插管补充体液，左颈动脉插管监测血压和心率。气管插管与犬齿动物呼吸机相连。体温用电热垫维持在３７ ℃。待心率和血压稳定后，施左胸切开术。暴露左冠状动脉左前降支（ｌｅｆｔ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ，ＬＤＣＡ），用丝线（６-０）缝合形成活的闭环。用止血钳子夹紧闭环造成左心室局部缺血，心肌缺血的标志是心包膜表面苍白且血压下降。松开止血钳再灌注。再灌注时血压略微上升。实验均为缺血３０ ｍｉｎ再灌注２ ｈ

　　１．３  心肌梗死面积大小的确定

　　左心室（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＬＶ）大小，梗死面积大小（ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ，ＩＳ），缺血区域（ａｒｅａ ａｔ ｒｉｓｋ，ＡＡＲ）均如先前描述方法测定［１］。简言之，在２ ｈ 再灌注后， ＬＤＣＡ再次被封闭。用埃文斯蓝颜料（２％）注入ＬＶ 腔， ＡＡＲ 为非蓝染色，蓝染者为正常灌注区。摘除心脏，冲洗多余的蓝颜料，将左心室横切为２ ｍｍ厚切片。切片在１０ ｇ／Ｌ ２，３，５-三苯基氯化四氮唑（２， ３， ５-ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＴＴＣ） ＰＢＳ 缓冲液染色１２ ｍｉｎ，梗死区为非 ＴＴＣ 染色，砖红色染色区为可逆活性组织。每层切片的上下两面均拍摄照片，使用 Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ 图像软件分析照片不同区域面积大小。每层切片两边的区域平均。ＡＡＲ表示为总 ＬＶ 的百分比，ＩＳ 表示为 ＡＡＲ 的百分比。

　　１．４  ｅＮＯＳ 纯化及免疫印迹分析

　　心脏左心室组织缺血区与其它部分分离，使用含 ＰＭＳＦ １ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｎａ２ＶＯ３ ２ ｍｍｏｌ／Ｌ，１０ ｇ／Ｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｃｏｃｋｔａｉｌ（美国 Ｓｉｇｍａ公司）的 ＲＩＰＡ 缓冲液冰上匀浆后以 １０ ０００ × ｇ，４ ℃离心３０ ｍｉｎ。上清液贮于－８０ ℃冰箱待测。总蛋白质浓度测定使用 Ｂｉｏ-Ｒａｄ 蛋白测定包，根据说明书测定。ｅＮＯＳ 的纯化依照Ｐｏｌｌｏｃｋ等［５］的方法进行，使用２′，５′-ＡＤＰ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｂｅａｄｓ（美国Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 公司）先纯化，后加样于聚丙烯酰胺胶体中，用电泳动方法将蛋白样品分离，并被转移在硝化纤维薄膜上。薄膜用５０ ｇ／Ｌ低脂牛奶封闭过夜。然后使用抗 ｅＮＯＳ 抗体（美国Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）标记。特定抗体被对 Ｘ 线敏感的化学发光物（ＥＣＬ ＲＰＮ２１０６，美国Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司）标记，并曝光于 Ｘ 线片上。

　　１．５  分析硝基酪氨酸

　　用免疫组化方法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析硝基酪氨酸。ＯＮＯＯ－的生成通过对其标志性产物ＮＴ的测定来代表。实验末心脏左心室组织缺血区与其它部分分离并植入ＯＣＴ液，用液氮冷冻至－８０ ℃，横切为２０ μｍ 厚切片。使用抗大鼠ＮＴ抗体 （Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ ）标记心肌内ＮＴ。使用 Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ 图像软件分析系统分析ＮＴ水平。

　　１．６  ＮＯ含量检测

　　用硝酸还原酶法测定ＮＯ含量。我们用Ｇｒｉｅｓｓ反应，通过对ＮＯ氧化反应的产物硝酸盐（ＮＯ２－）和亚硝酸盐（ＮＯ３－）水平总和的测定来反映血浆ＮＯ水平。实验末从颈静脉收集血液，冰上冷却３０ ｍｉｎ，然后以１０ ０００ × ｇ，４ ℃离心３０ ｍｉｎ，上清液贮于－８０ ℃冰箱待测。用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，按操作规程测定其ＮＯ２－／ＮＯ３－。制备亚硝酸钠和硝酸钠标准溶液，作出亚硝酸钠和硝酸钠浓度－５４６ ｎｍ ＯＤ值标准曲线。并计算出ＮＯ２－和 ＮＯ３－总量。

　　１．７统计学处理

　　实验数据用均数±标准差表示，用 Ｓｔａｔｖｉｅｗ 统计软件 ＡＮＯＶＡ 影响因素分析。检验水准α＝ ０．０５。

　　２ 结 果

　　２．１  血糖水平

　　在２周和１６周糖尿病组中，血糖水平分别是 （２９．０ ± １．９）ｍｍｏｌ／Ｌ 和 （２７．６ ± １．８）ｍｍｏｌ／Ｌ，相对应对照组 ２ＷＣ 和１６ＷＣ 血糖水平分别是（６．１ ± ０．３） ｍｍｏｌ／Ｌ 和 （６．３ ± ０．２）ｍｍｏｌ／Ｌ。糖尿病组血糖显著升高（糖尿病组血糖ｖｓ． 相应时间对照组； Ｆ ＝ ２０９８．９０， Ｐ ＜ ０．００１）。

　　２．２  平均动脉压改变

　　表１了糖尿病组和对照组平均动脉血压（ＭＢＰ）在缺血前、缺血期和再灌注期间的数值。在２ＷＤ 鼠中，在缺血前、缺血期、再灌注期 ＭＢＰ 均较对照组降低。在 １６ＷＤ 中，在缺血前、缺血期和再灌注期ＭＢＰ 数值与对照组无显著性差异。在 ２ＷＤ 和１６ＷＤ 组的再灌注期，ＭＢＰ 均较缺血前期降低。

　　２．３  梗死面积大小和缺血区面积大小

　　缺血和再灌注后，在 ２ＷＤ 组，梗死面积比对照组 ２ＷＣ 减少（分别为３５．００％ ± ３．００％，５１．００％ ± ３．３０％），在 １６ＷＤ 组中，梗死面积比对照组 １６ＷＣ 组增加 （分别为６１．００％ ± ３．００％，５０．００％ ±２．００％），糖尿病组与相应时间对照组有显著性差异，Ｆ＝１６．４， Ｐ ＜ ０．０５。缺血危险区域面积（ＡＡＲ）大小在 ２ＷＣ， ２ＷＤ， １６ＷＣ， １６ＷＤ 无组间差异。

　　２．４  心肌ｅＮＯＳ表达

　　免疫印迹分析显示ｅＮＯＳ在 ２ＷＤ 组中与 ２ＷＣ 大鼠相比提高大约３４％ （图１）。此外，ｅＮＯＳ表达在１６ ＷＤ 组中与 １６ ＷＣ 大鼠相比减少大约３８％。

　　２．５  ＮＯ含量检测

　　用硝酸还原酶法测定 ＮＯ 含量。在 ２ＷＤ 组中 ＮＯ 水平在基线和缺血再灌注后与对照组比较分别升高３６％和２５％。然而，在 １６ＷＤ 组血中 ＮＯ 水平在基线和缺血再灌注后与对照组比较分别降低４３％和２０％（图２）。

　　２．６  硝基酪氨酸测定

　　免疫组织化学染色显示缺血前ＮＴ在２ＷＤ 组较 ２ＷＣ 组低４９％（图３），在缺血再灌注后，ＮＴ 水平无显著差异。在 １６ＷＤ 组，缺血前及缺血再灌注后 ＮＴ 水平分别较 １６ＷＣ 大鼠升高２５％和２２％。

　　３ 讨 论

　　本实验结果显示糖尿病２周时，大鼠心脏在 Ｉ／Ｒ 后梗死面积比对照组减少，糖尿病１６周时，梗死面积比对照组增加。这表明糖尿病早期对心脏 Ｉ／Ｒ 损伤确有保护作用。 然而，至糖尿病１６周时这种保护作用不但消失，而且加重 Ｉ／Ｒ 的损伤。

　　多数学者认为，缺血－再灌注损伤是氧自由基介导的脂质过氧化、钙超载、无复流等因素的病理生理过程。近年来研究发现，血管内皮损伤和功能异常是引起缺血－再灌注损伤的又一重要原因，内皮源性舒张因子即ＮＯ释放减少是导致缺血－再灌注损伤的重要因素。ＮＯ是小分子气体， 可在许多细胞与组织合成。合成ＮＯ的前体为Ｌ－精氨酸， 在ＮＯＳ催化下合成ＮＯ。心肌细胞本身含有ＮＯＳ， 可自身合成ＮＯ。ＮＯ具有扩张冠脉、改善心脏血液供应、缩小心肌梗塞范围等作用。

　　研究显示ｅＮＯＳ在糖尿病心脏中的表达呈现矛盾的改变，包括增加［６］，减少［７］，无改变［８］。本研究结果ｅＮＯＳ 在心脏的表达与对照组相比在糖尿病２周时短暂升高，但是在１６周时却显著减少。这提示ｅＮＯＳ在糖尿病时的变化是一个随病程改变的过程，即早期ｅＮＯＳ代偿性合成增加而晚期则合成减少。相应的， 本研究中 ２ＷＤ 组中血浆 ＮＯ 水平在缺血前和再灌注期与对照组比较分别升高３６％和２５％。然而，在 １６ＷＤ 组血浆 ＮＯ 水平在缺血前和再灌注期与对照组比较分别降低４３％和２０％．这提示ＮＯ在糖尿病时的变化也是一个随病程改变的过程，即早期ＮＯ代偿性合成增加而晚期则减少。由于 ＮＯ 是血管舒张因子，早期水平的升高可解释为什么糖尿病大鼠２周时血压比对照组低。糖尿病早期高浓度 ＮＯ 除舒张血管和增加血流外，也是内皮细胞生存和心脏的保护因子，可抑制细胞凋亡。本研究显示，无论糖尿病组或对照组，缺血后ＮＯ含量明显增加，可能系血流阻滞后ＮＯ蓄积所致。

　　有学者发现糖尿病大鼠的血管内皮细胞合成ＮＯ的能力下降［９］。也有学者认为糖尿病动物或糖尿病患者的血管内皮合成ＮＯ并不减少［１０］，在某一阶段甚至反而增加，而糖尿病时生成的某些物质对ＮＯ的灭活，则是ＮＯ依赖的血管舒张障碍的主要原因。缺血－再灌注时， 在冠状动脉血流复通的开始几分钟，Ｏ２－（快速形成，并与ＮＯ反应形成 ＯＮＯＯ－，ＯＮＯＯ－是导致再灌注损伤的主要物质。ＯＮＯＯ－，高活性氧化剂，能硝基化酪胺酸蛋白质残基产生硝基酪胺酸。硝基酪胺酸具细胞毒性，可致细胞死亡。本研究中ＯＮＯＯ－的形成藉由硝基酪胺酸水平的测定来评估。

　　糖尿病时体内氧自由基生成增多，氧自由基极易与ＮＯ反应，如超氧阴离子（Ｏ２－·）即可与ＮＯ生成过硝酶根离子（ＯＯＮＯ－），从而使ＮＯ失活。研究表明［１０］糖尿病动物的血管内皮确实生成更多的Ｏ２－·，从而使ＮＯ失活增加。有报告认为自由基清除酶（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ， ＳＯＤ）如ＳＯＤ在糖尿病早期增加从而减少超氧化物的含量［１１］， 从而使ＮＯ失活减少，形成 ＯＮＯＯ－数量下降，有利于心肌细胞的存活。但在糖尿病慢性期时超氧化物（如Ｏ２－·）的含量升高，与 ＮＯ 反应形成 ＯＮＯＯ－，从而使ＮＯ失活增加，导致血管舒张障碍， 抗缺血再灌注能力下降，ＯＮＯＯ－水平显著升高， 促使心肌细胞死亡。这与本研究结果相符合，即ＮＴ含量在糖尿病早期比对照组低， 而在晚期比对照组高。

　　综上所述， ＳＴＺ 诱导糖尿病早期、晚期对心肌 Ｉ／Ｒ 损伤呈现相反的作用。这可能是由于早、晚期糖尿病相反的心肌 ｅＮＯＳ 表达，相应引起早晚期矛盾的ＮＯ及ＯＮＯＯ－改变而引起的。ｅＮＯＳ 在心肌的表达在糖尿病早期增加， 然而在慢性期减少；心肌保护因子 ＮＯ 血浆水平在糖尿病早期升高，但是在慢性期显著降低；具细胞毒性物质ＯＮＯＯ－生成的标志性产物硝基酪氨酸在糖尿病早期生成减少，但在慢性期显著增加。这说明在糖尿病的不同阶段、对心肌 Ｉ／Ｒ 损伤占主导地位的机制可能都有不同。

【】
  　　马国川，夏 焱，罗向阳，等．糖尿病大鼠生存信号改变对对缺血再灌注损伤及心肌细胞凋亡的影响［Ｊ］．中山大学学报：医学版，２００６，２７（５）：５１０-５１４．

　　ＳＵＮ Ｊｕｎｈｕｉ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ-ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ： Ａ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｒｄｉａｃ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２００７，５９（５）：５４４-５５２．

　　关永源，林 默．一氧化氮的药理作用［Ｊ］．新医学，１９９９，３０（１）：５５-５７．

　　Ｂａｃｋｌｕｎｄ Ｔ， Ｐａｌｏｊｏｋｉ Ｅ， Ｓａｒａｓｔｅ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｆｔｅｒ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｉａｂｅｔｅｓ［Ｊ］． Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ， ２００４，４７（２）：３２５-３３０．

　　马国川，夏 焱，苏浩彬，等． ＳＴＺ诱导糖尿病大鼠心肌ＶＥＧＦ表达及血管密度变化对缺血再灌注损伤的影响［Ｊ］．中山大学学报：医学科学版，２００６，２７（３）：２８１-２８４．

　　Ｓｔｏｃｋｋｌａｕｓｅｒ-Ｆａｒｂｅｒ Ｋ， Ｂａｌｌｈａｕｓｅｎ Ｔ， Ｌａｕｆｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｏｎ ｃａｒｄｉａｃ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２０００，１５３５（１）：１０-２０．

　　Ｓｒｉｄｕｌｙａｋｕｌ Ｐ， Ｃｈａｋｒａｐｈａｎ Ｄ， Ｂｈａｔｔａｒａｋｏｓｏｌ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｎｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｈｅｍｏｒｈｅｏｌ Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃ， ２００３，２９（３-４）：４２３-４２８．

　　Ｅｌ-Ｏｍａｒ ＭＭ， Ｌｏｒｄ Ｒ， Ｄｒａｐｅｒ ＮＪ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｐｏｓｔｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ ［Ｊ］． Ｅｕｒ Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ， ２００３， ５（３）：２２９-２３９．

　　Ｆｕ ＧＳ， Ｈｕａｎｇ Ｈ， Ｃｈｅｎ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｒｖｅｄｉｌｏｌ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ ［Ｊ］． Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００７，５６７（３）：２２３-２３０．

　　Ｍａ Ｇ， Ａｌ-Ｓｈａｂｒａｗｅｙ Ｍ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ ｓｈｏｒｔ-ｔｅｒｍ ｄｉａｂｅｔｅｓ： ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ＶＥＧＦ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｄｅｎｓｉｔｙ， ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］． Ｎａｕｎｙｎ Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００６，３７３（６）：４１５-４２７．

　　Ｂａｌｕｃｈｎｅｊａｄｍｏｊａｒａｄ Ｔ， Ｒｏｇｈａｎｉ Ｍ， Ｈｏｍａｙｏｕｎｆａｒ Ｈ， ｅｔ ａｌ．Ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｇａｒｌｉｃ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ-ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒａｔｓ ［Ｊ］． Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２００３， ８５（１）：１３９-１４４．