瘦素和VEGF的阳性细胞在卵巢子宫内膜异位症中的病理学研究

               作者：吴玲玲，余妙真 李琳，王振花

【摘要】  【目的】 探讨瘦素和血管内皮生长因子(VEGF) 在子宫内膜异位症（EMs）发病机制中的作用。【方法】 应用免疫组织化学法检测瘦素和血管内皮生长因子在28例卵巢子宫内膜异位囊肿患者的异位内膜、在位子宫内膜及20例正常子宫内膜中的表达特点。【结果】 ①腺上皮细胞中：瘦素和VEGF在异位内膜和在位内膜中的表达均高于正常子宫内膜(P< 0.05)，并且异位内膜中的表达高于在位内膜(P< 0.01)；②间质细胞中：瘦素在异位内膜中的表达高于在位内膜、正常子宫内膜(P< 0.01)，VEGF在异位内膜、在位内膜及正常子宫内膜中的表达差异无统计学意义（P >0.05）；异位内膜、在位内膜中的瘦素与VEGF均呈正相关表达(P< 0.01)。【结论】 瘦素和血管内皮生长因子在卵巢子宫内膜异位症的发病机制中发挥作用，两者在异位内膜和在位内膜中的血管生成过程中密切相关。

【关键词】  子宫内膜异位症； 瘦素； 血管内皮生长因子； 免疫组化

    Abstract: 【Objective】 To discuss the pathophysiological role of leptin and vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis. 【Methods】 Leptin and VEGF expression were detected in 28 ectopic endometrium, eutopic endometrium, and 20 endometrium of control group by immunohistochemical staining. 【Results】Ectopic and eutopic tissues showed statistically stronger leptin and VEGF expression compared with normal controls (P< 0.05) and ectopic tissues showed statistically stronger leptin and VEGF expression compared with eutopic tissues (P< 0.01) in glandular epithelium cells; Ectopic tissues showed statistically stronger leptin expression compared with eutopic tissues, normal controls in stroma cells (P< 0.01). However, we did not find difference about VEGF expression among ectopic tissues, eutopic tissues, or normal controls in stroma cells(P﹥0.05). Leptin expression was positively correlated to VEGF expression in ectopic endometrium and eutopic endometrium (P< 0.01). 【Conclusions】 Leptin and VEGF play an important role in the progression of endometriosis. There is close relationship between leptin, VEGF, and endometriotic angiogenesis.

    Key word: endometriosis; leptin; vascular endothelial growth factor; immunohistochemical staining

    子宫内膜异位症（简称内异症，ovarian endometriosis, EMs）是一种妇科常见病，其发病机制尚未明确。多数研究表明，逆流至腹腔的子宫内膜经历粘附、侵袭后，新生血管形成是进一步生长的必要条件。瘦素由脂肪细胞分泌，人体内瘦素浓度与体质量指数(BMI)呈正相关[1]。Sierra等[2]用瘦素处理人脐静脉血管内皮细胞将会引起浓度依赖性的细胞数量增加，表现为类似血管早期形态管状物的增加和新生血管的形成。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是一种特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，具有促进微静脉，小静脉通透性增加，血管内皮细胞分裂、增殖，细胞质钙聚集以及诱导新生血管形成等作用。本研究通过检测瘦素和VEGF在EMs患者异位内膜与在位内膜中的表达，探讨瘦素和VEGF可能在EMs发病机制中发挥的作用。

    １　  材料与方法

    １.１　  研究对象

    研究组：28份异位内膜和在位内膜均取自中山大学附属第二妇产科2004年12月～2006年4月期间住院手术、经病理确诊的卵巢子宫内膜异位囊肿并且见到完整的腺上皮及间质细胞的患者，且依据1985年美国生育学会(AFS)提出的“修正子宫内膜异位症分期法”(r-AFS)的评分标准均为Ⅲ～Ⅳ期患者，年龄23～48（S=35.5）岁， BMI（22.9±1.3） kg/㎡，在位内膜增生期19例，分泌期9例。对照组：同期在该院因浆膜下或肌壁间子宫肌瘤行手术的子宫内膜正常的20例非EM患者，年龄30～47（S=37.4）岁，BMI （S=23.3） kg/㎡,其中增生期10例，分泌期10例。研究组与对照组患者均为月经，近3个月未用过激素类药物，且排除糖尿病、高血压、心脏病、肥胖、子宫内膜癌，子宫腺肌病及多囊卵巢综合症(PCOS)等疾病的生育年龄妇女，两组年龄与BMI差异无统计学意义。

    1.2   方   法

    1.2.1   标本获取   在手术时取卵巢子宫内膜异位囊肿的囊壁组织、在位内膜组织及正常子宫内膜组织（未行全子宫切除术患者，征得知情同意下，术中用取内膜器取得子宫内膜），均以甲醛固定、石蜡包埋，并经病理检查证实。

    1.2.2   免疫组织化学检测　  本研究采用SABC（strept avidin?鄄biofin complex）法免疫组织化学测定，瘦素多克隆抗体、VEGF多克隆抗体均购自Santa Cruz公司。二抗试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。实验步骤参照试剂盒说明书进行。用已知的阳性乳腺癌切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

    1.2.3   结果判定   采用双盲法进行评分，每张切片随机观察10个有代表意义的高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取平均数作为结果。判定标准：阳性为细胞内出现黄色颗粒。表达阴性和阳性根据细胞染色强度和染色细胞所占面积,即两者积分之和来判断。染色强度分为：不染色为 0，轻度染色为 1，中度染色为 2，强度染色为 3。染色面积分为：无细胞染色为 0； < 25%细胞染色为 1； 25%～50%细胞染色为 2； > 50%细胞染色为3。若积分之和为 0，则表达阴性( - )；积分之和为 1～2 则表达弱阳性( + )；积分之和为 3～4 ,则表达阳性( ++ )；积分之和为5～6 ,则表达强阳性（+++ ) 。

    1.2.4   统计学处理   数据分析采用SPSS 11.0统计软件包进行：计量资料行t检验；计数资料采用秩和检验；瘦素和VEGF表达之间的相关性行Spearman相关性分析。取P< 0.05为差异有统计学意义。   

    2   结   果

    2.1   瘦素在异位内膜、在位内膜中的表达

    腺上皮细胞中：异位内膜、在位内膜中的表达均高于正常内膜（P＜ 0.01)；异位内膜中表达高于在位内膜（P＜ 0.01)。间质细胞中：异位内膜中表达高于在位内膜（P＜ 0.01)、正常内膜（P＜ 0.01)；在位内膜与正常内膜之间的表达差异无统计学意义（P ＞0.05）。瘦素在3组表达情况见表1，部分表达见图1。

    2.2   VEGF在异位内膜和在位内膜中的表达

    腺上皮细胞中：异位内膜、在位内膜中的表达均高于正常内膜（P＜ 0.01、＜ 0.05)；异位内膜中表达高于在位内膜（P＜ 0.01)。间质细胞中：异位内膜、在位内膜、正常内膜进行两两比较差异均无统计学意义（P ＞0.05）。VEGF在3组表达情况见表2，部分表达见图2。

    2.3   瘦素、VEGF在异位内膜、在位内膜中表达的相关性

    异位内膜中的瘦素与VEGF表达：在腺上皮细胞中的相关系数r1=0.846；间质细胞中的相关系数r2=0.844(P均＜ 0.001)。在位内膜中的瘦素与VEGF表达：在腺上皮细胞中的相关系数r3=0.918；间质细胞中的相关系数r4=0.890 (P均＜0.001)。 

    3   讨   论

    在内异症的病因学研究中，大多数学者支持Sampson学说，即子宫内膜种植学说。但不能解释：约90%妇女月经来潮时有经血逆流至腹腔，却只有10%发生内异症[3]。因此有学者[4]提出“在位内膜决定论”，即在位内膜作为异位种植的物质主体，在EMs的发生中起着决定性作用，这是对Sampson学说的修正和完善。

    本实验采用免疫组化的方法研究了瘦素在28例卵巢内异症患者异位内膜、在位内膜的表达，发现瘦素在异位内膜腺上皮细胞、间质细胞的表达均高于对照组内膜，与Wu等［5］的研究结果相似，提示异位内膜中的瘦素的高表达可能与异位病灶的生长、有关；在位内膜腺上皮细胞的表达高于对照组内膜，与Wu等结果不同，但是该学者只是对4例在位内膜进行了测定，样本量较少。因此我们认为瘦素在在位内膜与正常内膜之间表达的差异，提示前者在发生经血逆流后，容易发生异位种植，从而发生内异症。本研究显示，异位内膜腺上皮细胞、间质细胞中瘦素的表达高于在位内膜，我们考虑一方面源于腹腔微环境的影响，目前的资料表明，内异症患者腹腔液中巨噬细胞的数量和活性增加，分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α) 等细胞因子升高，并有研究[6]证明TNF-α可促进瘦素的分泌；另一方面瘦素在异位内膜间质细胞中的表达增高与瘦素自身的特性有关，即瘦素可以激发异位内膜间质细胞瘦素mRNA的表达，其上调作用呈剂量依赖性，且瘦素的这种正反馈作用仅见于异位子宫内膜，对在位内膜间质细胞不发生此作用[5] ，因此形成恶性循环，进一步促进了异位内膜中瘦素的表达，从而促进了内异症的进一步发展。

    本研究中：VEGF在异位内膜腺上皮细胞中表达高于对照组，差异有统计学意义，与王宁宁[7]、徐红 [8]等的研究结果类似，提示异位内膜中VEGF 的过度表达，可能使其具有很强的血管生成能力，异位内膜得以在异位存活并进一步的侵袭、发展，使病灶不断地扩大；在位内膜腺上皮细胞表达VEGF高于对照组，与徐红等[8]的报道一致，从在位内膜VEGF的促血管生成层面上佐证了“在位内膜决定论”的观点；但是我们的研究表明异位内膜腺上皮细胞VEGF的表达高于在位内膜，这一结果与徐红等[8]不同，分析可能与腹腔微环境的影响有关，主要是腹腔液中巨噬细胞的作用，一方面巨噬细胞自身产生VEGF[9]，另一方面其分泌的一些细胞因子如TNF-α等，从而通过自分泌或旁分泌机制实现对VEGF的上调。

    瘦素-受体信号转导主要通过酪氨酸激酶信号转导与转录（JAK-STAT）途径。VEGF作为一种血管生长因子，须与其受体结合后通过酪氨酸激酶传导通路而发挥作用。Suganami等[10]在一项瘦素对于局部缺血诱导的视网膜神经血管化的刺激研究中认为：其促进作用可能是通过上调视网膜内皮细胞的VEGF，并且VEGF mRNA升高至少部分是通过激活STAT3途径来实现。Kitade等[11]通过大鼠试验表明：瘦素的促血管生成作用及与VEGF的协同作用在非酒精性肝硬化发展为肝纤维化及肝癌的过程中发挥重要作用，并且瘦素通过促进VEGF生成发挥血管生成作用。另有学者认为：瘦素通过上调VEGF的分泌，在乳腺癌的发病中发挥重要作用，并且抑制瘦素分泌可能成为乳腺癌的研究方向[12]。可见，在一些疾病中，瘦素的促血管生成作用通过上调VEGF而实现[13]。本研究结果：异位内膜、在位内膜中瘦素与VEGF的表达均具有正相关性。VEGF被认为是最重要的血管形成因子，因此推论瘦素、VEGF在在位内膜、异位内膜的血管形成方面可能有密切联系，在卵巢内异症的发生发展中，瘦素有可能通过促进VEGF分泌而发挥促血管生成作用。

    本实验提示异位内膜、在位内膜中瘦素、VEGF的表达增高可能与卵巢内异症的发病有关，并且瘦素、VEGF在卵巢内异症中的作用可能具有内在的联系。但有关内异症中瘦素、VEGF的具体作用机制则有待于更进一步的研究，而对于瘦素与VEGF的深入研究有助于为内异症的治疗提供新的靶点。

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