迷迭香酸对慢性肾功能不全大鼠系膜基质及TGF?β1的影响

              作者：林威远, 黄荣桂, 郑兴中

【摘要】  目的 观察迷迭香酸对慢性肾功能不全模型大鼠系膜基质及转化生长因子?β1(TGF?β1)的影响。 方法 制作大鼠慢性肾功能不全模型(5/6肾切除),以迷迭香酸作为干预因素,应用免疫组织化学半定量法测定迷迭香酸对大鼠系膜基质成分纤维连接蛋白(Fn)、胶原Ⅳ(Col?Ⅳ)及TGF?β1的影响,电镜观察肾小球病变化,测定血、尿肌酐值。 结果 (1)与对照组比较,迷迭香酸组肌酐清除率(Ccr)水平升高(P<0.05);(2)Fn、Col?Ⅳ在肾脏细胞外基质的沉积减少(P<0.05);(3) TGF?β1表达减少(P<0.05)。 结论 迷迭香酸可以抑制TGF?β1的表达,减少Fn及Col?Ⅳ在肾小球细胞外基质的沉积,延缓肾小球硬化,对慢性肾功能不全疾病可能具有价值。

【关键词】  迷迭香酸; 肾小球; 细胞外基质; 肾切除术; 转化生长因子?β; 疾病模型,动物

　　细胞外基质(ECM)的增加是慢性进行性肾小球病变的特征,肾小球ECM积聚是肾小球疾病至肾小球硬化的主要病理改变基础。多种细胞因子通过对系膜细胞的作用参与调节肾小球ECM的分泌,导致肾小球结构和功能的异常,促进肾小球硬化。迷迭香酸(rosmarinic acid)为水溶性的多酚类化合物。1958年由Ellis首次从唇形科植物迷迭香(Rosmarinus offinalis L.)中分离得到，在植物中分布较为广泛,主要存在于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科的多种植物中。由于迷迭香酸为天然抗氧化剂,有抗炎、免疫抑制等多种活性,对其进行研究开发具有一定的意义。笔者观察迷迭香酸对慢性肾功能不全模型大鼠系膜基质及转化生长因子?β1(TGF?β1)的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  成年雄性SD大鼠20只,6～8周龄,体质量(175±15)g[上海西普尔?必凯实验动物有限公司,许可证号:SCCKCC(沪)2003?0002]。纤维连接蛋白(Fn)、胶原Ⅳ(Col?Ⅳ)、TGF?β1免疫组织化学(SABC法)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。迷迭香酸(含量97%,美国Aldrich公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  模型制备  大鼠分笼饲养于室温、日光照12 h、45%湿度的环境中,自由饮水,进食标准普通饲料。1周后采用Platt法切除5/6肾制作慢性肾功能不全模型[1],分2期完成:先背部切口切除左肾2/3,1周后切除完整右肾。术后2周静脉采血0.5 mL,查肌酐值,明显高于正常值(35～53 μmol/L)者符合入选标准。

　　1.2.2  分组  模型大鼠分为模型组和迷迭香酸组,未手术大鼠为对照组,每组6只。迷迭香酸组给予迷迭香酸100 mg·kg-1·d-1灌胃,另2组给予等容积蒸馏水灌胃。8周后,留24 h尿及心脏取血备查;切开腹腔,取出肾脏,4%甲醛缓冲液固定,石蜡包埋。另取部分肾组织，送电镜室检查。

　　1.2.3  免疫组织化学观察  采用SABC法,按试剂盒说明书操作。高倍镜(×200)下随机选择20个肾小球和20个肾小管?间质,根据染色面积和强度进行半定量评分:无染色或微弱染色为0，染色面积<25%为1，25%～50%为2，50%～75%为3，>75%为4;基本不着色为0,着色淡者(淡黄)为1,适中者(棕黄)为2,深者(棕褐)为3。两者得分相加为最终值。

　　1.2.4  尿肌酐和血肌酐测定  采用全自动生化分析仪(德国Becman公司)检测尿肌酐和血肌酐值,按公式换算成肌酐清除率:
   
　　肌酐清除率=[尿肌酐浓度(mg/mL)×1 min尿量(mL)]/血肌酐浓度(mg/mL)

　　1.3  统计学处理  数据用x±s表示,采用SPSS 11.0处理方差检验组间差异。组间两两比较采用LSD检验。

　　2  结果

　　2.1  免疫组织化学观测评分  迷迭香酸可以抑制TGF?β1表达,减少Fn及Col?Ⅳ在肾ECM沉积(表1)。

　　2.2  免疫组织化学改变  与对照组比较,模型组Fn及Col?Ⅳ表达明显增多,肾小球黄色及棕黄色、棕褐色面积大,着色深;迷迭香酸组Fn及Col?Ⅳ表达较对照组减少,黄色及棕黄色面积小,着色较浅。模型组TGF?β1表达较对照组明显增多,肾小管及间质黄色及棕黄色面积大,着色深;迷迭香酸组TGF?β1表达较对照组减少,黄色及棕黄色面积小,着色较浅(图1)。

　　表1  肾小球系膜细胞外基质及TGF?β1评分（略）

　　Tab 1  The effects of rosmarinic acid on the glomerular mesangium matrix and TGF?β1

　　n=6.  Fn:纤维连接蛋白; Col?Ⅳ:胶原Ⅳ; TGF?β1:转化生长因子?β1 .  与模型组比较, ☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

　　Fn:纤维连接蛋白; Col?Ⅳ:胶原Ⅳ; TGF?β1:转化生长因子?β1.  A:对照组; B:模型组; C:迷迭香酸组.

　　图1  Fn、Col?Ⅳ、TGF?β1表达(SABC法  ×200)  （略）

　　Fig 1  The expression of Fn,Col?Ⅳ and TGF?β1 in the kidneys(SABC×200)

　　2.3  病理学改变  光镜:模型组肾小球系膜细胞及系膜基质增生明显,有不同程度的萎缩、硬化,小球基底膜增厚,囊周纤维化,肾小管有扩张和萎缩,间质有大量炎症细胞浸润,伴纤维增生。迷迭香酸组系膜细胞及系膜基质增生程度和硬化程度较轻,基底膜较薄,肾小管扩张和萎缩改善,可见少量炎症细胞浸润(图1)。
   
　　电镜:模型组系膜细胞增生及系膜基质增生、扩大明显,并有少量沉积物,内皮下大量沉积物,上皮足突明显融合,结构紊乱;基底膜增厚,毛细血管壁增厚、萎陷;线粒体肿胀,溶酶体增多。迷迭香酸组系膜细胞及系膜基质增生程度较轻,足突结构基本正常,部分区域有轻度融合,基底膜增厚不明显(图2)。

　　2.4  血肌酐、内生肌酐清除率的变化  迷迭香酸对大鼠血肌酐、内生肌酐清除率的影响见表2。

　　3  讨论

　　3.1  肾小球系膜细胞的细胞外基质在肾衰过程中的作用  肾小球系膜细胞的ECM合成和降解的平衡对基质增生与否起关键作用[2]。大量研究证明, Col?Ⅳ分泌增多或多肽链结构异常均影响GBM的分子结构,导致肾小球滤过功能异常。近年研究发现,在肾小球硬化进展过程伴有Col?Ⅳ合成和/或降解异常,使其在病变肾小球中积聚,参与了硬化灶的形成[3?4]。在体内Fn有血浆型和组织型两种,在慢性肾功能衰竭时血浆型Fn消耗增加而产生抑制,故明显下降,但组织型Fn在组织中大量积聚[5]。本组大鼠模型有相同的表现。

　　3.2  迷迭香酸的药理作用及机制  迷迭香酸是咖啡酸和3,4二羟苯基乳酸形成的酯类,属于咖啡酸的一种衍生物,具有一系列的药理作用,如抗炎、免疫调节、抗氧化、抗血小板聚集及抗血栓、抗系膜细胞增殖等作用[6]。对于迷迭香酸对肾小球ECM及细胞因子的影响方法,Makino等观察迷迭香酸对兔抗鼠胸腺细胞血清诱导的系膜增殖型肾炎大鼠模型的影响,发现口服迷迭香酸(100 mg·kg-1·d-1)8 d后,系膜细胞增殖及系膜基质增生明显抑制,认为迷迭香酸主要通过它的纤维蛋白溶解活性及抗氧化活性而产生上述作用。他还观察了迷迭香酸对体外培养的鼠系膜细胞增殖的影响,发现它能抑制PDGF或TNF?β诱导的细胞增殖,主要作用于G0/G1及G1/S期的细胞,认为该作用机制主要是迷迭香酸抑制了系膜细胞PDGF及C?myc mRNA的表达[7?8]。

　　A:对照组; B:模型组; C:迷迭香酸组 

　　图2  肾小球的病改变(×3 600)  （略）

　　Fig 2  The pathology of the renal constitution examined(×3 600)

　　表2  大鼠血肌酐、内生肌酐清除率（略）

　　Tab 2  The effects of rosmarinic acid on the the Scr and Ccr of rats

　　n=6.  Scr:血肌酐; Ccr:内生肌酐.  与模型组比较, ☆:P<0.05,☆☆:P<0.01.

　　3.3  TGF?β对慢性肾功能衰竭的影响  TGF?β是一种调节细胞生长和分化的多肽,促使ECM沉积,主要通过以下3个途径:(1)明显增加ECM?胶原Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型以及Fn表达;(2)通过减少MMP表达以及促进PAI(纤溶酶原激活抑制物)和TIMP的合成来减少ECM的降解;(3)刺激ECM受体——整合素的合成,使细胞粘附于ECM,而富含ECM的基膜也作用于细胞,调控TGF?β的产生。Takashi等用Northern Blot杂交发现残余肾小球有TGF?β1 mRNA的表达,进一步观察到尿毒症时血清硫酸吲哚酚含量增高,利用5/6肾切除大鼠模型通过饮水和腹腔注射给予硫酸吲哚酚,发现实验2.5周时残肾TGF?β1 mRNA表达增加,而肌酐、肌酐清除率正常,但5周时则出现肾功能下降,证明TGF?β1 mRNA的异常高表达是慢性肾衰进展的启动因素而非结果的表现[9]。Yamamoto等用免疫染色和原位杂交技术检测人肾小球疾病TGF?β及mRNA表达,发现基质增多不明显的肾小球疾病中TGF?β表达明显增强,另外还见到TGF?β的3个亚型中以TGF?β1型表达加强为主,可见TGF?β1的表达与基质病理性增多有关[10]。本实验结果显示,迷迭香酸对TGF?β1的表达有抑制作用,可改善肾脏纤维化。

【】
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　　[10]Yamamoto T,Noble N A,Cohen A H,et al. Transforming growth factor?β isoforms in human glomerular diseases[J]. Kidney Int, 1996,49(2):461?469.