姜黄素对神经病理性痛大鼠脊髓背角c?fos表达的影响
【摘要】 ［目的］观察姜黄素对神经病理性痛大鼠痛行为及脊髓背角原癌基因c?fos表达的影响。［方法］采用大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）模型。雄性SD大鼠108只，随机分为实验对照组、假手术组、溶剂对照组、姜黄素组。采用von Frey 纤维丝和热痛刺激仪测定大鼠热痛缩爪潜伏期（TWL）和机械性缩爪潜伏期(MWT)，在术后3、7、14天处死（n=6）,用免疫组织化学方法测定c?fos蛋白在脊髓背角神经元的动态变化。［结果］CCI大鼠术侧脊髓背角浅层内Fos阳性神经元明显增多，姜黄素可减轻神经病理痛大鼠的痛行为，也能够明显减少脊髓背角神经元中Fos表达。［结论］姜黄素能减轻神经病理性痛，其机制可能与降低Fos蛋白的合成有关。
【关键词】 姜黄素；c?fos；神经病理性痛；脊髓；大鼠
Abstract： ［objective］To investigate the effects of curcumin on the behavior of chronic constrictive injury(CCI) rats and the c?fos expression in spinal cord dorsal horn.［Methods］108 male SD rats were randomly divided into 4 groups:Control group(treated with CCI);Sham operation group;Solvent contrast group;Curcumin treated group.Thermal withdrawal latency(TWL) and mechanical withdrawal threshold(MWT) of rats were determined by Hargreave’s thermal radiation apparatus and von Frey’s method of microfilament，respectively.The time course of expression of c?fos were assessed by immunohistochemical analysis.［Results］Curcumin could significantly attenuate the activation of c?fos induced by CCI and simultaneously ameliorate thermal and mechanical hyperalgesia induced by CCI.［Conclusion］This study shows that curcumin could attenuate the activation of c?fos to ameliorate the CCI?induced neuropathic pain.
Key words: curcumin;c?fos;neuralgia;spinal cord;rat
神经病理性痛主要表现为痛觉过敏（包括热痛敏和机械痛敏两种类型），由于其机制复杂，现有的疼痛方法均无显著疗效，给患者带来了极大的痛苦，因而成为疼痛学研究的热点。有研究表明，细胞外信号调节激酶和JNK参与了神经病理性痛的信号转导［1］。姜黄素具有痛经止痛的作用，又是一抗炎、抗肿瘤药物,同时又可抑制JNK［2］。本研究通过动态观察姜黄素腹腔注射后对CCI模型大鼠的行为学及脊髓背角原癌基因c?fos表达的变化，旨在探讨姜黄素对于神经病理性痛的作用及其可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂 雄性SD大鼠，体重200～280g，由温州医学院实验动物中心提供［实验动物使用许可证编号：SYXK(浙2005-0061)］。兔抗c?fos IgG多抗（产品标号：sc?52），为美国Santa Cruz公司产品，姜黄素购自美国Sigma公司。姜黄素用二甲基亚砜溶解配置成30、100、300mg/kg贮存液，避光于4℃冰箱保存。
1.2 模型制备 神经病理性痛模型 参照Bennett和Xie方法［3］建立CCI模型。1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉。在大腿中点通过股二头肌钝性分离并暴露坐骨神经，接近三股分叉处，游离神经约7mm，松松结扎4道(4.0铬肠线)，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动为宜，相隔lmm，受影响神经长4～5mm，缝合肌肉皮肤。假手术组大鼠仅暴露坐骨神经不进行结扎。
1.3 实验分组 雄性SD大鼠108只，随机分为6组，每组6只。实验对照组（Con），不给予任何药物；假手术组（Sham），大鼠游离右侧坐骨神经但不结扎；溶剂对照组(SC)，腹腔注射二甲基亚砜；姜黄素组（Cur30）、（Cur100）、（Cur300）分别术后每天腹腔注射30、100、300mg/kg的姜黄素。
1.4 行为学测定 坐骨神经松扎前连续测定大鼠缩足行为2d,然后从造模后d1、d3、d5、d7、d10、d14分别采用热辐射法（热痛觉过敏）［4］和von Frey细丝法（机械性痛觉过敏）［5］测定热刺激缩足反射潜伏期（TWL）机械缩足反射阈值（MWT）的变化。大鼠适应环境30min 后用一系列标准化的纤维丝von Frey(美国Stoelting公司产品)刺激后肢足底中部,如大鼠在刺激时间内或移开von Frey 纤维丝时出现快速缩足或舔足反应为阳性反应,每次间隔30s,以15g为上限热辐射法即按Hargreaves方法，将大鼠置于底为3mm 厚玻璃板的有机玻璃箱(22cm×12cm×22cm)中,使其适应30 min 后用热辐射刺激仪(50 w,12 v)发出5 mm 光斑照射大鼠足底,记录从照射开始至大鼠出现抬腿回避时间即为TWL，记录照射开始至大鼠出现抬足时间,为避免组织损伤以30s为上限。连续测定3次,每次间隔5min,取平均值为TWL。
1.5 免疫组织化学 大鼠分别于CCI后3、7、14 d在1% 戊巴比妥钠40mg/kg麻醉下,经主动脉灌注生理盐水100mL,继而灌注4% 多聚甲醛400ml，制作SD大鼠L4-5脊髓、背根神经节石蜡切片，54℃恒温水浴展开，晾干备用。60℃烤片至石蜡溶解，二甲苯梯度酒精脱蜡。抗原高压热修复，枸橼酸修复液（pH6.0）煮至微沸，放入切片，喷气10min，离开热源自来水流水冷却。3％过氧化氢封闭10min，滴加1∶100的一抗，4℃孵育24h，取出后室温复温20～30min，加二抗37℃孵育2 h 后PBS 冲洗，DAB 显色,苏木素轻度复染8min，盐酸化酒精酸化5秒，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片,光镜观察。
1.6 图像分析 c?fos免疫组织化学染色,切片采用LEICA Qwin 图像处理与分析系统进行图像分析。每张切片取CA1 区中1/3段测量平均灰度值,然后减去此片背景平均灰度值,取其相反数作为最终光密度值(OD)。
1.7 统计分析 所有数据采用 表示,采用SPSS11.0 统计软件进行统计分析，组间相比采用单因素方差分析，组内比较采用t 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 姜黄素对CCI大鼠TWL差值的影响 各组大鼠基础值TWL差值均无明显差异；Con组与SC组无显著性差异；Sham组大鼠术前和术后各时间点TWL差值无显著性差异；Cur组与SC组相比，每个时间点的TWL差值均明显减小（P<0.01）；Cur组大鼠的TWL差值明显高于其他组，并且Cur100组的TWL在d5、d7、d10均高于另两组不同浓度的Cur组（见表1）。
表1 腹腔注射姜黄素对CCI大鼠TWL差值的影响（略）
与Sham组比较：*P<0.05，**P<0.01；与Cur100比较：#P<0.05，##P<0.01。
2.2 姜黄素对CCI大鼠MWL差值的影响 各组大鼠基础MWT差异无显著性；Con组与SC组无显著性差异；Sham组大鼠术前和术后各时间点TWL差值无显著性差异；Cur组与SC组相比，每个时间点的TWL差值均明显减小（P<0.01）；Cur组大鼠的MWL差值明显高于其他组，并且Cur100组的MWL在d5、d7、d14高于Cur300组（见表2）。
表2 腹腔注射姜黄素对CCI大鼠MWL差值的影（略）
与Sham比较：*P<0.05，**P<0.01；与Cur100比较：#P<0.05，##P<0.01。
2.3 腹腔注射姜黄素对CCI 引起的脊髓背角神经元内c?fos表达的影响 实验发现CCI只引起同侧脊髓背角内c?fos阳性神经元的增加，对侧背角内c?fos 阳性神经元表达很少。Sham组术侧脊髓背角有少量的c?fos蛋白表达，Con组与SC组无显著性差异；Cur组与SC组相比，每个时间点的c?fos蛋白表达均要低（P<0.01），Cur100组的c?fos蛋白表达要低于其他两组Cur组（P<0.05或P<0.01）；在第3天的时候，作用最明显（P<0.05）（表3）。
表3 姜黄素对CCI大鼠脊髓背角c?Fos蛋白表达的影响（略）
与Sham比较：*P<0.05，**P<0.01；与Cur100比较：#P<0.05，##P<0.01。
3 讨论
本研究结果显示，术后腹腔注射姜黄素能减轻CCI大鼠神经病理性痛的痛行为，术侧的原癌基因c?fos的表达也下降。神经病理性痛是由于各种原因引起的神经损伤或者神经系统功能紊乱所导致的，是一种难治的慢性疼痛，现有疼痛的方法以药物镇痛为主，但镇痛效果疗效较差，是临床的顽症之一。因此研究神经病理性痛的发生机制和探索有效的治疗方法具有很重要的医学和社会价值。
既往研究表明神经病理性痛的产生、慢性化与本根神经节(DRG)神经元（外周机制）和脊髓背角神经元（中枢机制）的可塑性改变（主要是兴奋性增强）有关［6?7］。伤害性刺激条件下MAPK家族成员能诱导DRG神经元发生敏感性增加、兴奋性增强等可塑性改变。JNK又叫应急激活蛋白激酶，使c?Jun N端转录活化区的Ser 63和Ser 73磷酸化，提高其转录活性。在脊神经结扎模型，损伤后JNK在DRG神经元表达增加，用JNK抑制剂可以减轻损伤后触诱发痛［8］。原癌基因c?fos的表达产物Fos蛋白,在胞浆形成后迅速入核,与c?jun 表达产物Jun 蛋白通过亮氨酸拉链形成同源或异源二聚体复合物?转录因子AP?1,结合至靶基因启动子的AP?1位点及TPA 反应序列,转而调节后期反应基因的表达，使细胞产生长期适应性的变化［9］。Fos表达是神经元兴奋性长时程变化的第一步，是痛觉过敏状态的反映，伤害性刺激引起Fos表达可能是通过启动脊髓内源性抑制机制极力对抗过度的刺激，但同时也导致痛觉过敏，痛阈降低。本实验发现CCI对照组术侧c?fos明显增加。
本实验发现姜黄素能有效的减轻CCI诱发的痛温觉过敏，并维持一定的时间，尤其是浓度为100mg/kg的姜黄素组的作用效果最为明显。同时还观察到姜黄素能够降低CCI引起的核内Fos蛋白表达水平，与大鼠神经病理性痛行为改善一致。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素,具有破血行气，通经止痛，散风活血的作用。对姜黄素的分子药研究表明,姜黄素具有多方面药理作用,如抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗微生物等作用。综上所述，姜黄素抑制JNK［2］，进而抑制c?fos的表达可能是姜黄素能改善神经病理性痛的机制之一。
【】
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