益气补肾温经法对去卵巢大鼠股骨颈骨形态计量学的影响

               作者：吴连国 陈华 史晓林 刘康 徐建春 毛应德龙 朱彦昭 

【摘要】  ［目的］观察自拟强骨饮对骨质疏松症的骨形态计量学的影响，并探讨其机制。［方法］健康雌性SD大鼠90只，体重230～280g。随机分为3组，分别为组、对照组和空白组，每组30只。分别采取切除双侧卵巢方法进行骨质疏松造模，10周造模成功后，开始给药，治疗组用自拟强骨饮灌胃，每日一次，每次1ml/g，对照组用密盖息，皮下注射，每日1次，每次0.72u/kg。空白组，不做处理。在给药后3、4.5、6个月每组各取10只大鼠进行检测，先测量体重，空气栓塞处死，分离股骨颈，获得股骨颈样本，经切片等处理后，显微镜下作骨形态计量学检测。［结果］给药后治疗组3个月骨体积分数与密盖息组数据相比有统计学意义，与空白组相比骨小梁厚度、骨小梁间距、骨体积分数都具有统计学意义。给药后4.5个月强骨饮组骨小梁厚度与密盖息组相比差异均有统计学意义。给药后6个月强骨饮组骨小梁厚度、骨小梁间距与密盖息组相比均具有统计学意义。

［结论］自拟强骨饮可以明显改善骨形态计量学指标，可能是通过刺激成骨细胞生长，抑制破骨细胞活性，并抑制高骨转趋势来实现的。

【关键词】  强骨饮;骨形态计量学;骨质疏松症；益气补肾温经；实验研究

　　Abstract：［Objective］To explore the bone histomorphology effect of QiangGuYin on neck of femur of ovariectomized rats.［Methods］Ninety femal SD rats，weight 230～280 gram，were rangdonmized into three groups: QiangGuYin group（treatment group），Miacalcic group (contrast group) and control group.All rats were variectomized.After 10 weeks，the osteoporosis model succeed，the treatment group，contrast group were given QiangGuYin，Miacalcic respectively.The treatment group used QiangGuYin everyday，1ml/g.The contrast group used Miacalcic 0.72u/kg，everyday hyodermic.And 3，4.5，6 months after the treatment，kill 10 rats to explore.The neck of femur were cut and stined with Masson Golder Trichrome for bone histomorphomemetric contrast group analysis.［Result］The treatment group ovariectomized rats’ in 3m，BV/TV compared with statistical significance;compared with control group in Tb.sp，BV/TV，Tb.Th with statistical significance.After 4.5m treatment group Tb.Th compared with contrast group have statistical significance.Give the medicine 6m，Tb.sp，Tb.Th compared with contrast group all have statistical significance.［Conclusion］Giangguyin can effectively improve the histomorphometry index.The mechanism probably is stimulating osteogenesis and supperssing the cytoactive of osteoclast and trend of the high bone transform.

　　Key words:Qiangguyin;histomorphometry;ostroporosis；experimental research;TCM therapy
   
　　骨质疏松症是妇女绝经后常见的一种全身性代谢骨骼疾病，因骨丢失所造成的病理性骨折的发生率逐年增加，严重损害了老年妇女的健康，目前对骨质疏松的防治研究已成为医学领域的重要课题。以益气补肾温经立法的自拟强骨饮为我院中药协定处方，是我院根据传统中医理论及中药研究成果，结合名老中医的临床经验设计而成，用于治疗骨质疏松症。具有益气补肾，温经通络的功效，临床取得了明显疗效。为从多环节探讨自拟强骨饮的药物功效，本研究以切除大鼠卵巢建立去卵巢骨质疏松症模型，观察强骨饮对其股骨颈骨组织形态计量学的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物  健康雌性SD大鼠90只，体重230～280g。由浙江中医药大学动物实验中心提供。

　　1.2  实验药物  治疗组用自拟强骨饮（为浙江中医药大学附属第二协定处方，由浙江中医药大学附属第二医院中药库提供）；对照组1密盖息针剂,50iu/支，由北京诺华制药有限公司提供；对照组2为空白组。

　　1.3  实验仪器  硬组织切片机，是由上海第九人民医院提供的Krumdieck组织切片机。秤是由上海凯士有限公司提供的ＡＤ电子秤。

　　1.4  实验方法

　　1.4.1  动物选择和分组  选择90只SD雌性大鼠，随机分成治疗组和2个对照组，每小组各30只。

　　1.4.2  动物造模  手术前记录每只大鼠体重。手术过程：无菌条件下，用3%的戊巴比妥（40mg/kg，上海化学试剂公司提供）腹腔麻醉大鼠，手术打开腹腔，摘除双侧卵巢，结扎血管，缝合腹腔。待大鼠清醒后，每天给大鼠肌肉注射庆大霉素（广东三良堂药业有限公司）一次，每次1ml，连续注射三天。

　　1.4.3  用药观察  造模成功后(术后10周)，治疗组用药为自拟强骨饮，用常规中药煎煮法，按大鼠体表面积换算而成:鹿角霜210mg/kg，忍冬藤210mg/kg，鸡血藤150mg/kg，秦艽230mg/kg，防风210mg/kg，露蜂房180mg/kg，肉桂180mg/kg，川芎210mg/kg，黄芪210mg/kg，骨碎补210mg/kg，杜仲150mg/kg，川断150mg/kg，灌胃，每次约1ml，1.5个月1疗程。对照组1为密盖息针剂，50iu/支，皮下注射，每次0.72u/kg，每日1次。对照组2为空白组，不做任何处理。

　　1.4.4  取材  分别于给药后第3月，4.5月，6月各取10只(空白组在相应时间段检测)。先测量体重，用空气栓塞处死，分离股骨颈，去除股骨颈肌肉筋膜，获得股骨颈标本，作骨形态计量学检测。

　　1.4.5  固定方法  处死后，剔除股骨颈肌肉筋膜，每一个标本放入标本瓶中，酒精固定。保留周围少量肌肉，福尔马林固定。然后脱钙，脱水，包埋，硬化，然后二甲苯透明，封固。

　　1.5  测定指标  在物镜放大率为4倍的显微镜下，以相同的间隔移动切片，使所有的显微视野均经数码相机输入机自动图像处理系统（上海极品光电科技有限公司）。测算以下参数：①B.ar骨小梁面积；②T.ar整体松质骨面积；③B.Pm骨小梁周长。
   
　　由以上参数，通过下列公式计算出骨形态计量学指标：

　　骨体积分数BV/TV=100*B.ar/T.ar  骨小梁厚度Tb.Th=(B.ar/B.pm)(∏/2)
   
　　骨小梁间距Tb.sp=(1000*T.ar?B.ar)/B.pm

　　1.6  统计学方法  计量资料数据均用x±s表示。利用SPSS13.0统计软件，计量资料两样本均数之间的比较用t检验，多样本均数之间的比较用方差分析，均以P<0.05为差异显著的标准。

　　2  结果
   
　　组与对照组相比，具有统计学意义的指标为：①骨体积分数（BV/TV）：在第3个月有统计学意义，治疗组优于对照组；②骨小梁厚度(Tb.Th)：在第4.5和第6个月有统计学意义，治疗组优于对照组；③骨小梁间距(Tb.sp)：在第6个月有统计学意义，治疗组优于对照组。治疗组与空白组相比，各观察时间3个指标相比均具有统计学意义。

　　表1  3个月强骨饮组与密盖息组股骨颈骨形态计量学指标的比较（略）

　　强骨饮组与密盖息组组间比较，*P<0.05

　　表2  4.5个月强骨饮组与密盖息组股骨颈骨形态计量学指标的比较（略）

　　强骨饮组与密盖息组组间比较，*P<0.05

　　表3  6个月强骨饮组与密盖息组股骨颈骨形态计量学指标的比较（略）

　　强骨饮组与密盖息组组间比较，*P<0.05

　　3  讨论
   
　　肾虚不足，骨失所养，是骨质疏松症发生的主要病机。《素问·宣明五气论》篇曰:“肾主骨”，《 素问·阴阳应象大论》曰:“肾主骨髓”、“ 在体为骨”。《 素问·六节脏象论》:又言“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也，其华在发，其充在骨”。说明肾与骨有着密切的关系，肾之精气充足，则骨骼发育正常，骨质致密。若肾之精气不足，则髓枯骨痿，骨质疏松。中药组方治疗骨质疏松症主要以补肾益气，通络止痛为治则，作为具有“ 多成分、多靶点，协同促进增效、配伍适中安全”特征的中药(草药)复方已经开始引起人们开发的兴趣［1］。自拟强骨饮由黄芪、鹿角霜等12味中药组成，以益气补肾，温经通络为主。方中重用黄芪益气行滞，与鹿角霜补肾助阳共为君药，达到益气补肾之功，二者咸甘并用，均入肾经，达到鼓舞肾阳的目的，与骨质疏松症的机理相合，因骨质疏松症多由年老体亏、肾气亏乏，不能主骨生髓所致。黄芪与鹿角霜并用，益气补肾以达到壮阳增髓生骨之效。佐以川芎、鸡血藤、忍冬藤、秦艽、露蜂房与肉桂温经通络，因补血行血，通络以助气行，肉桂本性有补火助阳之功，以温煦肾阳助骨生长，诸药相合，温经通络，补肾助阳，能治疗腰脊酸软、牵涉做痛、筋脉抽搐、腰背支撑不能、行走痛甚以治其标。诸药相伍，通达阴阳，标本相合，达到益气补肾，温经通络之效。经过毒研究，证明该方无明显毒副作用，适合长期服用。经过临床观察应用研究，该方对促进骨的成骨细胞形成，抑制破骨细胞活性方面，以及骨质疏松症的所致的疼痛、肌痉挛等症状的疗效良好，应用后骨质疏松症的生化指标检测呈良性趋势，骨密度提高明显［2］。
   
　　骨组织显微结构的改变是导致骨质疏松症及并发骨折的重要病理环节，骨组织形态计量学指标，常能直接反映骨形成与骨吸收的重要指标，也是评估骨转换状态和骨质疏松程度、诊断分型及确定疗效的重要指标。骨计量学方法可以精确地反映出骨重建过程的变化和特点，并有可能就此提出某一时段用药治疗的方针，同时也能对病人所处的状态做出正确的估价，更好地指导临床治疗。故在骨质疏松的研究中已经成为一项不可缺少的基本技术，无论在疾病的发生机理研究，还是在药物疗效的评价中都有着广泛的应用价值［3］。
   
　　本研究与对照组比，初期大鼠（第3个月）由于去卵巢，其骨形成和骨吸收参数是升高的，所以治疗组与对照组相比，其指标改善情况较差，表现出了骨形成和骨吸收同时升高的高转换型骨代谢特征，说明该组有明显的骨丢失。治疗组（第3个月、第4.5月）对去卵巢后的骨量丢失抑制作用不明显，表现为与对照组比较除了骨体积分数增加有显著性意义以外，其余两项参数的差异均无显著性意义，未能抑制高转换型骨代谢特征，因此其与对照组比较，骨吸收有增高趋势。治疗组在第6个月对指标改善较明显，表现为与对照组比较除了骨体积分数有显著性意义以外，骨小梁间距和骨小梁厚度等均有显著性意义，可见其对去卵巢后的骨量抑制作用明显加强，即起到了抑制高转换型骨代谢。
   
　　因此，以益气补肾温经立法的自拟强骨饮可较好的改善去势大鼠的骨形态计量学指标，其原理可能是通过刺激成骨细胞生长，抑制破骨细胞活性，并抑制高转换骨代谢趋势来实现的。

【】
  　　［1］ 张戈.绝经后髋部骨质疏松性骨折风险的研究进展［J］.中医骨伤科杂志,2003,11(1):49?52.

　　［2］ 史晓林.自拟强骨饮治疗骨质疏松症的32例临床报告［J］.中国中医骨伤科杂志,2006,14(2):33?34.

　　［3］ Ott SM,Oleksik A,Lu Y,etal.Bone histomorphometric and biochemical marker results of a 2?year placebo?controlled trial of raloxifene in postmenopausal women［J］.J Bone Miner Res,2002,17(2):341?348.