HV单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P的构建和表达

                作者：陈锐，杨洁，张芳琳，秦炜炜，王涛，张瑞，孟艳玲，胡刚，徐志凯，杨安钢

【摘要】  目的：构建汉坦病毒（Hantavirus， HV）单链抗体/鱼精蛋白片段融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P基因的原核表达载体，蛋白经表达后纯化并进行1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的功能活性鉴定. 方法：采用PCR的方法，扩增单链抗体基因1A8 ScFv和1A8 ScFv/Cκ，将鱼精蛋白片段的编码序列设计入扩增引物，获得HV单链抗体/鱼精蛋白片段的融合蛋白基因1A8 ScFv/Cκ/P. 将获得的重组基因克隆入原核表达载体pET32a，并在大肠杆菌BL21中表达. 表达产物经SDS?PAGE和Western Blot鉴定，用Ni?NTA螯合层析介质进行纯化. 采用ELISA方法分析1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白与HV抗原的结合活性，凝胶迁移阻滞实验检测1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白与质粒DNA的结合活性. 结果：成功构建了HV 1A8 scFv/Cκ/P融合蛋白基因的表达载体，在大肠杆菌中实现了可溶性表达. 通过功能活性测定，纯化的1A8 scFv/Cκ/P融合蛋白既保持了与HV抗原的结合能力，同时又具有与核酸的结合活性. 结论：构建和表达的HV 1A8 scFv/Cκ/P融合蛋白具有HV抗原结合活性和DNA结合的活性.

【关键词】  汉坦病毒; 单链抗体; 鱼精蛋白; 融合蛋白; 靶向输送

     0引言

    选择性地转移基因到体内各种类型细胞和器官，可以对人类疾病尤其是肿瘤和病毒感染性疾病进行靶向［1］. 鱼精蛋白（protamine，P）是一种碱性蛋白，截短至22个(8～29)富含碱性氨基酸片段仍然保留着核酸结合功能. 单链抗体（single chain，scFv），分子小，穿透力强，免疫原性低，有导向载体功能. 我们构建和表达一种由汉坦病毒（Hantavirus，HV）核蛋白的单链抗体（1A8 scFv）和鱼精蛋白片段组成的融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P， 以期获得具有抗原结合活性和核酸结合活性的1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白.

    1材料和方法

    1.1材料1A8VH?LGL/W6E和3G1VH?LALCkGsHis 质粒、Vero?E6细胞、汉坦病毒76~118株(第四军医大学微生物教研室)；pET32a载体，大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)，（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室）；限制性内切酶、连接酶（TaKaRa公司）；IPTG（Promega公司），质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒（合肥优晶生物技术有限公司）；HiTrap Ni?NTA螯合层析介质(Invitrogen公司)；HRP?6 His tag antibody（abcam公司）；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司）.

    1.2方法

    1.2.1PCR引物和鱼精蛋白片段序列设计扩增1A8 ScFv和1A8 ScFv/Cκ基因的引物，同时将鱼精蛋白片段的序列设计入3′ 端引物. 扩增1A8 ScFv的引物，  S5:  5′?tttgaattccaggtccagctgcaggag TC?3′；S3：5′?tttgtcgacacgtttgatctcgagct?3′；扩增1A8 ScFv?Cκ序列的引物， Cκ3：5′?tttgtcgacacactctcccctgttgaagc?3′ ；采用引物二次延伸的办法在Cκ之后引入编码鱼精蛋白片段的寡核苷酸序列（双下划线部分），其引物如下：P1：5′?ttgtctctggcggtaatatctgctccggctctggctgcgacactctcccctgttgaagc?3′，P2：5′?tttgtcgacgctccgcct ccttcgtctgcgacttctttgtctctggcggtaatatc?3′；在两端引物中分别引入EcoR I和Sal I酶切位点（单下划线部分），引物由北京奥科生物技术有限公司合成.

    1.2.21A8 ScFv/Cκ/P融合基因重组表达载体的构建及鉴定分别以质粒1A8VH?LGL/W6E和3G1VH?LALCkGsHis为模板，通过限制性酶切和PCR方法克隆1A8 ScFv/Cκ/P基因，将其克隆入PET32a质粒，转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆，酶切鉴定，对酶切鉴定正确的克隆进行测序，将测序正确的质粒命名为pET32a?1A8 ScFv/Cκ/P.

    1.2.31A8 ScFv/Cκ/P融合基因的诱导表达及鉴定将正确的重组质粒pET32a?1A8?ScFv /Cκ/P转化大肠杆菌BL21，挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，次日以1∶100接种，37℃培养至A600 nm达0.6左右，加入IPTG终浓度为0.2 mmol/L，30℃诱导培养6 h，取5 mL未诱导及诱导菌液离心收集菌体，以200 mmol/L Tris·HCl (pH 8.0)重悬，超声裂菌后离心，取少量上清，加入等量2×SDS Loading Buffer，沉淀重悬于适量1×SDS Loading Buffer，煮沸5 min,离心后取上清进行SDS?PAGE分析，凝胶薄层扫描分析蛋白表达情况. 同时对表达产物进行Western Blot鉴定，蛋白样品经SDS?PAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜，以脱脂奶粉室温封闭，依次加入鼠抗6 His mAb（1∶400稀释，4℃孵育过夜），HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5000稀释，室温1 h)，用化学发光试剂盒于暗室条件下X光片感光显影.

    1.2.4表达产物的分离纯化取100 mL诱导菌收集菌体，用200 mmol/L Tris·HCl (pH 8.0)重悬，冰浴中超声6次（每次2 min，间隔10 s），4℃，12 000 g离心20 min，用镍?次氨基三乙酸(Ni2+?NTA)螯合层析介质4℃旋转结合过夜，咪唑洗脱缓冲液洗脱. 各取少量洗脱液进行SDS?PAGE分析.

    1.2.5ELISA检测融合蛋白的抗原结合活性胰酶消化Vero E6细胞，调整细胞密度为2×108/L，以100 μL/孔加入96孔细胞培养板，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养24 h，加100 μL汉坦病毒76~118株（107 TCID50/L），37℃吸附90 min. 加入200 μL/孔含20 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养7 d. 待细胞长满孔板，去培养液， 用2.5 mL/L戊二醛固定10 min. 在孔中分别加入100 μL不同稀释梯度的蛋白样品， 37℃孵育1 h. 加入鼠抗6 His mAb (1∶10 000稀释)，37℃孵育1 h. 加入底物液100 μL/孔，37℃，10 min显色，终止反应后测定各孔A492 nm值.

    1.2.6融合蛋白的核酸结合活性检测采用凝胶迁移阻滞实验. 将1 μg线性化质粒DNA分别与不同量的1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白于0.2 mol/L NaCl溶液中室温孵育30 min，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，观察结果.

    2结果

    2.1重组表达载体的构建及鉴定PCR分别扩增出长度为750 bp的HV 1A8 ScFv基因片段、1068 bp的1A8 ScFv?Cκ片段和1134 bp的1A8 ScFv/Cκ/P片段，片段的大小均与预期长度一致（图1A）. 1A8 ScFv/Cκ/P基因克隆入PET32a载体，克隆的酶切鉴定正确(图1B). 核苷酸序列测定结果正确.

    A1： DL2000 marker；2：1A8 ScFv基因的PCR产物；3：1A8 ScFv/Cκ基因的PCR产物；4：1A8 ScFv/Cκ/P基因的PCR产物. B1： DL2000 marker；2： pET32a?1A8 ScFv；3： pET32a?1A8 ScFv/Cκ； 4： pET32a?1A8 ScFv/ Cκ /P（EcoR I, Sal I）.

    图11A8 ScFv/Cκ/P基因的PCR扩增产物和其重组质粒的酶切鉴定

    2.21A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的诱导表达及鉴定与空载体相比，经0.2 mmol/L IPTG诱导后细菌裂解上清及沉淀中均出现Mr约为60 000的新生蛋白带，与预期的1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的大小相符. 光度扫描显示，1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的可溶性表达量占上清蛋白的30.9%（图2A）. 经Western Blot分析证实，新生蛋白带即为带有6 His标签的1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白，表明目的蛋白表达成功，且以可溶性表达为主（图2B）.

    A1：低分子质量蛋白marker； 2：pET32a空载体诱导全菌； 3：pET32a?1A8 ScFv/ Cκ/P未诱导全菌；4： pET32a?1A8 ScFv/ Cκ/P诱导全菌；5：pET32a?1A8 ScFv/Cκ/P诱导菌裂解上清；6： pET32a?1A8 ScFv/Cκ/P诱导菌裂解沉淀. B1： pET32a?1A8 ScFv；2： pET32a?1A8 ScFv/Cκ； 3： pET32a?1A8 ScFv/Cκ/P.

    图21A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的SDS?PAGE及Western Blot分析

    2.31A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的纯化SDS?PAGE显示1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白获得有效纯化，经薄层扫描分析，其纯度达到86%以上(图3). 经BCA法测定蛋白浓度，纯化的1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的平均浓度为400 mg/L.

    1： 低分子质量蛋白marker；2： 与Ni?NTA结合前的细菌裂解上清； 3： 与Ni?NTA结合后的细菌裂解上清； 4： 100 mmol/L咪唑洗脱液；5： 200 mmol/L咪唑洗脱液； 6： 300 mmol/L咪唑洗脱液； 7： 400 mmol/L咪唑洗脱液；  8：  500 mmol/L咪唑洗脱液.

    图31A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的纯化和SDS?PAGE分析

    2.41A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的抗原结合活性检测ELISA检测结果发现，随稀释梯度的逐渐增加，1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白与HV抗原的结合活性也减弱，提示表达与纯化的融合蛋白能够与HV抗原特异性地结合. 与1A8 ScFv相比，1A8 ScFv/Cκ/P仍保持良好的HV抗原结合活性（图4）.

    图41A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白抗原结合活性的ELISA检测

    2.51A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白的核酸结合活性检测凝胶迁移阻滞实验结果显示，1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白与质粒DNA作用后，可以使DNA的迁移速率变慢，并且随着1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白量的增加，DNA的迁移速率也随之越慢，表明该融合蛋白能够结合DNA分子（图5）.

    1： marker DL2000； 2： 1 μg质粒DNA；3： 1 μg质粒DNA+10 μg 1A8 ScFv；4： 1 μg质粒DNA+10 μg 1A8 ScFv/Cκ； 5： 1 μg质粒DNA+1 μg 1A8 ScFv/Cκ/P；6： 1 μg质粒DNA+4 μg 1A8 ScFv/Cκ/P； 7： 1 μg质粒DNA+10 μg 1A8 ScFv/Cκ/P.

    图5凝胶迁移实验检测1A8 ScFv/Cκ/tP融合蛋白与DNA的结合活性

    3讨论

    siRNA等小分子的临床应用所面临和需要克服的一项难题是基因药物的靶向输送. 使用抗体介导的靶向输送策略可能更具效力［1］.

    ScFv将抗体重链可变区和轻链可变区通过一段柔性短肽连接起来. 由于只保留了可变区，免疫原性大大降低，因而成为导向药物的理想载体［2］. ScFv可与其他效应分子融合构建成多种具有双重功能的分子，最常见的如免疫毒素、放射性同位素标记的ScFv等［3-4］. 鱼精蛋白是富含碱性氨基酸的碱性蛋白［5］. 鱼精蛋白氨基酸8～29片段，依然保留着与核酸的结合作用 ［6］. 我们将HV 核蛋白的1A8 ScFv与鱼精蛋白片段在基因水平融合，为了避免两个结构域之间空间结构的相互影响，在两个基因之间插入了一段轻链恒定区编码序列，以期获得具有靶向性和核酸输送性能的双功能活性融合蛋白1A8 ScFv/Cκ/P.

    我们将重组的表达载体转化大肠杆菌BL21， 1A8 ScFv/Cκ/P融合蛋白以可溶性表达为主，表达量占30.9%以上. 采用Ni2+?NTA螯合层析介质成功的从表达菌裂解上清中纯化出了高纯度的融合蛋白. 融合蛋白功能活性的检测结果表明，其抗原结合活性并没有明显的变化，而且，1A8 ScFv/Cκ/P具有明确的核酸结合活性. 该融合蛋白的成功表达和其功能活性的特点，使其有望成为HV感染的基因有效的靶向输送工具.

【】
  ［1］ Song E, Lee SK, Wang J, et al. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis ［J］. Nat Med, 2003, 9(3) ：347-351.

［2］ Suzuki M, Takayanagi A, Shimizu N. Targeted gene delivery using humanized single?chain antibody with negatively charged oligopeptide tail ［J］. Cancer Sci, 2004, 95(5)：424-429.

［3］ Wen WH, Liu JY, Qin WJ. Targeted inhibition of HBV gene expression by single?chain antibody mediated small interfering RNA delivery［J］. Hepatology， 2007, 46(1)：84-94.

［4］ Wen WH, Qin WJ, Gao H. An hepatitis B virus surface antigen specific single chain of variable fragment derived from a natural immune antigen binding fragment phage display library is specifically internalized by HepG2.2.15 cells［J］. J Viral Hepat, 2007, 14(7)：512-519.

［5］ Junghans M, Kreuter J, Zimmer A. Antisense delivery using protamine?oligonucleotide particles ［J］. Nucleic Acid Res, 2000, 28(10): e45.

［6］ Li X, Stuckert P, Bosch I, et al. Single?chain antibody?mediated gene delivery into ErbB2?positive human breast cancer cells ［J］. Cancer Gene Therapy, 2001, 8(8)：555-565.