小牛椎体骨质疏松模型的快速建立
【摘要】 目的： 利用乙二胺四乙酸二钠（EDTA?Na2）脱钙法快速建立牛椎体骨质疏松模型. 方法： 4具新鲜小牛脊柱，每具选取第6～13节椎体，共32个椎体，采用随机区组设计方法，分成Ⅰ~Ⅷ共8个区组；采用4种处理方法： A处理组（EDTA?Na2脱钙3 wk），B处理组（EDTA?Na2脱钙2 wk），C处理组（不使用EDTA?Na2脱钙），D处理组（EDTA?Na2脱钙4 wk）. 分别检测各组椎体骨密度(BMD)后，拧入相同规格的通用性脊柱内固定系统（UPASS）椎弓根螺钉，测试其最大轴向拔出力（Fmax）及能量吸收值，同时各组取少量松质骨制成组织切片. 结果： A，B，D处理组的BMD均值，Fmax均值及能量吸收值均值都低于C处理组（P<0.01），A，D处理组的BMD均值，Fmax均值及能量吸收值均值都低于B处理组（P<0.01），A，D处理组之间差异无统计学意义（P>0.05）. 切片显示A，D处理组骨小梁较C组骨小梁变细、数量轻度减少,间距增宽,骨髓腔扩大. 结论： 应用EDTA?Na2对牛椎体进行脱钙，可在较短的时间内建立用于生物力学研究的牛椎体骨质疏松模型.
【关键词】 骨质疏松；疾病模型，动物；生物力学；EDTA?Na2；骨密度
0引言
由于骨质疏松造成的椎弓根螺钉松动、拔出的情况在临床工作中很常见，给脊柱外科手术带来了极大困难［1］. 如何提高椎弓根螺钉在骨质疏松患者的固定强度已成为国内外研究的热点. 本实验利用乙二胺四乙酸二钠（EDTA?Na2）对新鲜小牛椎体进行脱钙处理，以期为相关研究建立一种简便、快捷的实验模型.
1材料和方法
1.1材料新鲜小牛脊柱4具，每具选取第6～13椎体，8节共32个椎体，X线和骨密度检查均无明显的骨质疏松、先天性畸形、骨折和肿瘤等病变；去除软组织，分解为单个椎体并保持每个椎体的完整性. EDTA?Na2，NaOH(天津市化学试剂三厂)；椎弓根螺钉采用通用性脊柱内固定系统（universal poly axial spinal system, UPASS）钉（6.5 mm×40 mm）（山东威高骨科材料有限公司）；双能X线吸收骨密度（bone mineral density, BMD）仪(美国Lunar Corp公司)；拉伸试验机(AGS?J, 日本岛津公司)；leica?LA全自动研究显微镜（德国莱卡公司）.
1.2方法
1.2.1实验分组采用随机区组的设计方法. 4具新鲜小牛脊柱，每具选取第6～13节椎体共8节椎体，采用随机区组设计方法分成Ⅰ～Ⅷ共8个区组；根据随机原则，分配至4个处理组：A处理组（EDTA?Na2脱钙3 wk），B处理组（EDTA?Na2脱钙2 wk），C处理组（不使用EDTA?Na2脱钙），D处理组（EDTA?Na2脱钙4 wk）.
1.2.2标本脱钙处理所有椎体均用标准4.0 mm丝攻预制双侧椎弓根钉道，然后浸入40 g/L甲醛固定6 h，再取出清水冲洗、浸泡12 h. C处理组不用EDTA?Na2脱钙处理；A，B，D处理组用0.595 mol/L的EDTA?Na2脱钙液2400 mL（加入NaOH 约0.713 mol/L以调整pH值为7.0)，分别浸泡2，3和4 wk. 每日2次用20 mL注射器将浸泡椎体的0.595 mol/L EDTA?Na2脱钙液向每个椎弓根钉道内注射，每周更换1次脱钙液（脱钙液的浓度和量均不变）.
1.2.3标本检测分别于2，3 和4 wk后从脱钙液中取出A，B，D处理组，使用双能X线吸收BMD仪分别检测每个椎体的BMD；随后在每个椎体双侧拧入UPASS椎弓根螺钉，用超硬石膏垂直包埋于特制钢制容器中，采用日本岛津AGS?J系列拉伸试验机，以5 mm/min的速度轴向牵拉，直至螺钉被拉出，记录最大轴向拔出力(Fmax)及能量吸收值.
1.2.4组织切片观察A，B，C，D各组中分别取钉道周壁松质骨制作组织切片，leica?LA显微镜下观察.
统计学处理： 采用SPSS13.0 统计软件分析. 不同处理组BMD均值、Fmax均值及能量吸收值均值均采用随机区组的方差分析及Dunnett?t检验进行比较，BMD与Fmax作Pearson相关分析, Microsoft Office Excel 2003软件制图表. P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1BMD, Fmax, 能量吸收值各处理组的BMD，Fmax和能量吸收值均值（表1）. 通过随机区组的方差分析，结果显示，A，B，D处理组的BMD均值、Fmax均值及能量吸收值均值都低于C处理组（P<0.01），A，D处理组的BMD均值、Fmax均值及能量吸收值均值都低于B组（P<0.01），A和D处理组之间差异无统计学意义（P>0.05）.
表1各不同处理组的骨密度（BMD）、最大轴向拔出力(Fmax)和能量吸收值（略）
bP<0.01 vs C.
2.2脱钙时间对BMD和Fmax的影响脱钙的时间越长，BMD越低（图1）；脱钙的时间越长，椎弓根螺钉的Fmax也越小（图2）.
图1骨密度?时间变化（略）
图2最大轴向拔出力?时间变化（略）
2.3BMD和Fmax的相关性分析将BMD与Fmax进行相关性分析，Pearson相关系数r=0.884，P<0.01，显示BMD与椎弓根螺钉的Fmax存在线性正相关（图3）.
2.4组织切片观察组织切片结果显示,C处理组（未脱钙组）骨组织中骨小梁丰富,相互交连成网状；A处理组（脱钙3 wk）,D处理组（脱钙4 wk）骨小梁与C处理组相比，骨小梁变细、数量减少, 相互联结分离,间距增宽,骨髓腔扩大，但变化均匀，保持了松质骨正常的形态结构.
图3骨密度与椎弓根螺钉最大轴向拔出力的散点图（略）
3讨论
近年来椎弓根螺钉固定技术已经广泛应用于脊柱退行性病变，骨折，畸形等病症［2-3］，但是在骨质疏松的患者，椎弓根螺钉的松动、拔出的情况却很常见，并且随着人类寿命的延长和我国老龄化社会的到来，这一问题越来越突出. 为解决这一问题，国内外开展了大量的研究［4］，目前用于脊柱生物力学研究的骨质疏松动物模型是以去势雌性山羊为代表的动物模型［5-8］，但也存在下列几点不足：① 模型建立时间长：目前公认需6 mo左右；② 建立过程繁琐且费用高：需先为羊做去势手术，术后还需行消炎等治疗；需饲养6 mo方能进行实验；③ 模型的可靠性差：季节、生育、营养状况、健康状况、接受光照情况等不确定因素都可以影响模型BMD的变化，导致模型的可靠性较差. 所以，建立一个快速、简便且满足脊柱生物力学研究需要的骨质疏松模型就显得非常必要.
本实验中选用EDTA?Na2作为脱钙剂，相对于HCL等其它脱钙剂，虽然脱钙速度慢，但有一个突出优点——对细胞等微观结构的破坏要小的多；实验中加入NaOH以调整pH值为7.0，也是防止pH值过低对椎体微观结构的破坏. 用20 mL注射器将浸泡椎体的脱钙液向每个椎弓根钉道内注射2次/d，能促使脱钙液更好的进入椎体内部，起到更好的脱钙效果. 每周更换相同浓度和量的脱钙液1次，以保持相对恒定的脱钙液浓度，这样既加强了脱钙的效果，又排除了脱钙液浓度变化对脱钙效果的影响，以便更好的观察脱钙时间长短对BMD的影响.
实验中采用每具小牛脊柱的第6～13节椎体共8节椎体，是由于这8节椎体的形态结构及大小很接近，且和人体的胸腰椎结构相似. 通过对实验结果的分析，发现随着脱钙时间的延长，BMD明显下降，椎弓根螺钉的Fmax均值及能量吸收值均值也都明显下降. 目前临床上一般将BMD下降到相同人种、相同性别年龄组人群BMD均值75％~87％的患者诊断为骨量减少，BMD低于75％的患者诊断为骨质疏松，BMD低于63％的患者诊断为严重骨质疏松［9-10］. 采用这一标准，将C处理组与A，B，D处理组对照，均已满足建立动物椎体骨质疏松模型的要求. 通过对BMD与椎弓根螺钉Fmax进行相关性分析，得出BMD与Fmax存在正相关，也进一步证明了BMD的减低将直接影响椎弓根螺钉的固定强度.
综上所述，用0.595 mol/L的EDTA?Na2脱钙液（pH 7.0）对牛椎体进行脱钙处理，完全可以满足建立用于生物力学研究的牛椎体骨质疏松模型的需要，其优点：① 快速、简便、费用低；② 可靠性好；③ 通过调整脱钙的时间，还可以调控模型的骨质疏松程度. 该模型作为离体模型，虽不能替代去势雌性山羊为代表的活体动物模型，但可以快速、准确的为脊柱生物力学的实验研究提供验证数据，从而为进一步的活体动物实验可靠的依据.
【】
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