早期康复训练对缺氧缺血大鼠脑结构和认知功能的影响

【摘要】  目的： 探讨早期康复训练对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑组织结构和认知功能的影响. 方法: 24只SD大鼠随机分为正常对照组、HIBD组、HIBD康复干预组. HIBD组和HIBD康复干预组按Rice法建立HIBD模型，HIBD康复干预组于建模后72 h开始进行为期30 d的早期康复训练. 通过Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力，观察脑重量变化，HE染色检测海马及皮层神经元病变. 结果: (1) HIBD组大鼠学习与记忆保持能力均低于HIBD康复干预组和正常对照组，HIBD康复干预组测试成绩与正常对照组相比无统计学差异.（2）HIBD组和HIBD康复干预组建模侧脑重均低于正常对照组［(0.638±0.019) g］，HIBD康复干预组的建模侧脑重［(0.428±0.085) g］，高于HIBD组［(0.348±0.043) g］. 三组大鼠未建模侧脑重无明显差异.(3) HIBD组和HIBD康复干预组大鼠脑皮层和海马存活神经元较正常对照组少. 但与HIBD组相比，HIBD康复干预组存活神经元数量增多. 结论： 早期康复训练对围产期HIBD后脑认知功能恢复具有一定的作用，可促进损伤后脑神经细胞的存活，促使脑损伤修复.

【关键词】  缺氧 脑 脑缺血 脑损伤 康复 Morris水迷宫 大鼠

　　0引言

　　围生期缺氧缺血性脑损伤(hypoxia?ischemic brain damage，HIBD)是儿童脑瘫和癫痫的重要原因之一［1］. 近年来有关早期康复训练对其影响的研究已成为热点. 临床研究提示,早期康复训练可促进HIBD患儿损伤脑组织功能的恢复；然而是否能同时促进损伤后脑组织结构的恢复，无法得到直接的病证据. 为此，我们对HIBD新生大鼠进行早期康复训练，同时观察其脑组织结构和认知功能的改变.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　7日龄SD大鼠24只(重庆医科大学动物实验中心提供). 电热恒温水浴箱（上海跃进医疗器械厂），Morris水迷宫，石蜡包埋机，石蜡切片机，显微镜（日本Olympus公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组及模型的制备24只SD大鼠随机分为正常对照组、HIBD组、HIBD康复干预组. 参照Rice法［2］建立HIBD动物模型，具体为大鼠经乙醚麻醉后于预部正中切口，分离左颈总动脉，用4-0丝线行双线结扎，缝合皮肤. 手术结束后动物回窝恢复4 h，然后将其放入置于37℃水浴的密闭缺氧箱中(容积10 L)，持续充以80 mL/L氧氮混合气体，气流量0.5 L/min，维持2.5 h. 缺氧完毕后，继续让动物在缺氧箱内休息15 min再放回窝中. 正常对照组只游离而不结扎左颈总动脉，亦不予缺氧处理. 各组大鼠均由母鼠代养.

　　1.2.2康复训练方法对HIBD康复训练干预组，按以下方法进行康复训练：

　　早期搬动触摸：自建模后72 h开始，每日将幼鼠与母鼠分离，用毛刷从头部到尾部沿脊柱轻刷幼鼠，每分钟40次，持续15 min，结束后将母鼠和幼鼠同时移回笼内，连续10 d.
 丰富环境刺激：参照Diamond等［3-4］方法设计丰富环境. 根据大鼠习性，在60 cm×40 cm×40 cm笼子内置入不同颜色及形状的物体、房屋、管道、斜坡、秋千、各种塑料“玩具”、带有芳香气味的棉球等，且每周通过增加或变换笼内的物体而改变环境2次，以造成新的刺激. 早期触摸结束后（生后21 d或损伤后14 d)，动物断奶，每日将干预组大鼠暴露于丰富环境刺激中2 h，持续20 d. 其间注意避免其它的噪音刺激.
非干预组及正常对照组大鼠于生后21 d断奶后饲养于28 cm×18 cm×15 cm标准饲养笼内，持续20d.

　　1.2.3学习记忆能力测定所有大鼠于41日龄，以Morris水迷宫测试空间记忆能力.(1)定位航行试验：测量获取学习记忆的能力. 第1天让大鼠自由游泳2 min，从第2天起，每天上午训练4次，每次从不同点入水，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(即潜伏期)，连续5天. 如果大鼠在120 s内未找到平台，潜伏期为120 s.(2)空间探索试验：测量保持空间位置记忆的能力. 上述6天实验结束后，于次日上午撤除平台，选择第3象限池壁中点作为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录在120 s内跨过该象限平台相应位置的次数.

　　1.2.4脑重测定水迷宫测试结束后，将大鼠断头取脑，用镊子夹去双侧嗅球，脑干沿小脑下缘修平，保留绒球小结叶，沿中线对剖，用纱布擦干表面血迹，用天平分别秤取左右半球脑重量.

　　1.2.5病理改变秤取脑重并肉眼观察脑形态变化后，立即将左半球固定于40 g/L甲醛缓冲液中，常规石蜡包埋，冠状连续切片，HE染色观察神经元坏死，重点观察海马和大脑皮层的改变. 在400倍显微镜下，随机观察海马CA1区和额叶皮层各5个视野并计数正常神经元数目. 取每个视野平均值作为每组代表值.

　　统计学处理: 数据以 x±s表示，采用SPSS软件进行统计学处理. 多均数间比较采用方差分析, 两两比较用SNK?q检验. 以P<0.05为有统计学差异.

　　2结果

　　2.1学习记忆能力测试在经历5 d的水迷宫训练中，各组大鼠的寻台潜伏期均随训练时间延长而呈下降趋势，但HIBD组与正常对照组和HIBD康复训练组间成绩始终存在统计学差异. HIBD组大鼠的寻台潜伏期长于正常对照组和HIBD康复训练组(P<0.01). HIBD康复训练组寻台潜伏期与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05，表1). 表1不同组大鼠寻台潜伏期的动态变化(略)

　　HIBD组、HIBD康复干预组、正常对照组大鼠在120s内穿越平台次数分别（8.8±2.1），（11.6±3.0），（12.9±3.0）. 与正常对照组和HIBD康复干预组相比，HIBD组大鼠穿越平台次数减少(P<0.01)，而HIBD后予大鼠进行为期40 d的康复训练后，穿越平台次数与正常对照组相比无统计学差异.

　　2.2大鼠脑重变化在缺氧缺血后大鼠造模侧（左侧）脑组织平均重量均低于正常对照组(P<0.01)，但HIBD康复干预组大鼠的平均脑重高于HIBD组(P<0.05). 而各组间非造模侧（右侧）脑重无统计学差异(表2). 表2不同组大鼠左右两侧脑重的比较(略)

　　2.3病理改变大体标本观察，正常对照组大鼠左侧大脑半球形态结构正常，与右侧半球大小无明显差异. HIBD组大鼠其左侧大脑半球体积明显小于右侧，出现明显的液化坏死和空洞形成. HIBD康复干预组大鼠其左侧大脑半球体积亦明显小于右侧，仍有空洞形成. 三组大鼠其右侧大脑半球形态结构均正常. 正常对照组大鼠，其海马和皮层神经元形态结构正常(图1A,B). HIBD组大鼠其海马和皮层大量神经元出现变性和坏死，散在存留少数正常神经细胞(图2A,B). HIBD康复干预组大鼠其海马和皮层亦有大量变性和坏死的神经元出现，散在一些正常神经细胞(图3A,B). 在400倍光镜下对在大脑乳头体水平面切片上对海马CA1区和额叶皮层进行存活神经元计数(表3). 每只大鼠取5张切片，在400倍显微镜下，随机观察海马和皮层各5个视野，取平均值作为每组代表值. 表3各组大鼠脑额叶皮质和海马CA1区存活神经细胞数(略)

　　3讨论

　　在临床研究中发现，早期康复训练在改善HIBD患儿运动功能的同时，对认知功能也有改变. 因此，康复训练对脑功能的改善是否同时具有相应的形态学变化呢？

　　按不同时期脑发育组织学特征推断，生后8 d的SD大鼠相当于人类新生儿期；生后20 d相当于人类婴儿期；生后28 d则相当于人类2岁的儿童；而2~3 mo相当于人类成年期［5］. 因此，本文使用相当于人类新生儿的7日龄大鼠为实验对象，建立HIBD模型作并进行康复训练. 本实验采用的康复训练方法由早期搬动触摸和丰富环境刺激两部分组成. 其中，用毛刷对幼鼠进行刺激类似母鼠在代养幼鼠过程中舔幼鼠的行为，这种行为可促进幼鼠的海马神经元发育和认知功能的成熟. 丰富环境包括各种不同颜色玩具的视觉刺激；各种不同形状、质感物体的触觉刺激；秋千、楼梯、平衡木的平衡功能训练；带有芳香气味的棉球进行嗅觉刺激. 训练4 wk后，经过水迷宫实验证实，HIBD康复训练干预组大鼠的寻台潜伏期明显低于HIBD组，与正常对照组相比无显著差异；而其120 s内跨越平台次数明显多于HIBD组，与正常对照组相比亦无显著差异. 从而证实早期康复训练可促进缺氧缺血后损伤脑组织认知功能的恢复.

　　进一步的形态学研究发现，无论是受损侧大脑半球的重量，还是存活细胞数，HIBD康复干预组大鼠均高于HIBD组大鼠，提示早期康复训练可明显促进HIBD后神经元的存活，可能对减少神经元死亡，促进脑结构的修复具有一定的作用. 我们推测HIBD大鼠经康复干预后，病损脑组织内神经元的变化主要与影响神经元凋亡或迟发性神经元死亡有关［6-7］.早期康复训练抑制迟发性神经元死亡的机制尚不完全清楚，推测可能有以下机制：(1)新生大鼠HIBD后丘脑部位神经退行性病变是由Fas死亡受体介导的细胞凋亡，早期干预可抑制半胱天冬酶3的活性而发挥脑组织的保护作用［8］;(2)BDNF在神经元存活和突触可塑性中发挥着重要作用，早期干预可使海马部位BDNF表达增加，促进突触发育，减少神经元凋亡［9］. 与成熟期脑相比，未成熟脑具有高度可塑性，存在脑发育的“关键期”. 在此关键期内，脑在结构和功能上具有很强的适应和重组能力，易受环境和经验的影响. 因此，对于HIBD患儿，应尽早进行早期康复训练，以更好促进脑组织结构和认知功能的恢复，改善其预后. 同时，进一步确认脑功能恢复的最佳“时间窗”［10］，探索康复训练促进脑结构与认知功能恢复的机制，将为临床开展系统康复提供理论依据.

【】
  　　［1］Perlman JM. Summary proceedings from the neurology group on hypoxic?ischemic encephalopathy［J］. Pediatrics,2006,117(3):28-33.

　　［2］Rice JE3rd, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic?ischemic brain damage in the rat［J］. Ann Neurol,1981,9(2):131-141.

　　［3］Diamond MC. Response of the brain to enrichment［J］. An Acad Bras Cienc,2001,73(2):211-220.

　　［4］Lippert?Grüner M, Maegele M, Pokorny J, et al. Early rehabilitation model shows positive effects on neural degeneration and recovery from neuromotor deficits following traumatic brain injury［J］. Physiol Res, 2007,56(3):359-368.

　　［5］Moshe SL. Brain injury with prolonged seizures in children and adults［J］. J Child Neurol,1998,13(1):3-6.

　　［6］Xu WH，Ye QF，Xia SS. Apoptosis and proliferation of intrahepatic bile duct after ischemia?repefusion injury［J］. Hepatob Pancreat Dis Int,2004,3(3):428-432．

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　　［8］Han BH, Xu D, Choi J, et al. Selective, reversible caspase?3 inhibitor is neuroprotective and reveals distinct pathways of cell death after neonatal hypoxic?ischemic brain injury［J］. J Biol Chem,2002,277(33):30128-30136.

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