bcr?abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立

【摘要】  目的: 构建bcr?abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病（CML）样模型,为深入研究CML发病机制和奠定基础. 方法: bcr?abl逆转录病毒Mig210载体经Phoenix?Ampo细胞包装后,取上清液感染5?FU 处理后的BALB/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线（900cGy）照射的同种雌性受体鼠中.用形态学、RT?PCR和Western Blot鉴定小鼠成模情况. 结果: 小鼠移植8~9 wk后，外周血白细胞达2×1010~3×1010/L（为对照鼠的5~8倍）,外周血涂片幼稚细胞达到0.10~0.20;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植4~5 wk后在受体鼠骨髓和脾脏检出bcr?abl融合基因,8~9 wk后在肝脏亦检测出bcr?abl融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到bcr?abl融合蛋白.建模成功的小鼠3~5 mo后相继死亡.结论： 成功建立bcr?abl逆转录病毒介导的小鼠CML模型,可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究.

【关键词】  慢性粒细胞白血病 BCR 融合蛋白 逆转录病毒载体 动物模型

　0引言
 
　　慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）是一种起源于骨髓内异常多能干细胞的骨髓增殖性疾病,其发病机制复杂,但持续表达的bcr/abl融合基因在该病的形成过程中起重要作用.目前在含有bcr/abl融合基因的细胞模型上进行研究的报道较多. 对CML体内研究的模型主要是基于bcr?abl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖,以及用K562细胞移植裸鼠成瘤后,再接种到免疫缺陷型小鼠致白血病的方法［1］.而利用逆转录病毒转染的小鼠骨髓移植模型研究人类白血病细胞的发生、及其生物学特性,并用来进行实验治疗,是20世纪90年代以来国外白血病实验研究的新发展［2］,国内尚未见报道.本课题拟探索建立bcr?abl逆转录病毒Mig210骨髓转染/移植诱导的小鼠白血病样模型,为后续CML信号通路和治疗机制的研究奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料BALB/c小鼠，6~12 wk龄，体质量21~23 g, 雌雄各半, 均为清洁级动物,由本校动物中心提供.逆转录病毒载体MIGR?P210由美国Warren S Pear教授惠赠.小鼠急性粒单核白血病细胞株WEHI?3购于医学院基础医学细胞中心.RT?PCR试剂盒购于TakaRa公司;转染试剂jetPEITM 为Polyplus公司产品;聚凝胺(Polybrene)为Sigma公司产品;抗c?abl多克隆抗体、二抗为抗兔Ig?HRP,羊抗鼠α?tubulin mAb，ECL显色试剂盒均购于Cell Signaling公司;rmIL?3，rmIL?6，rmSCF均购于PeproTech公司.

　　1.2方法

　　1.2.1逆转录病毒上清的制备将Mig210和MigRI空载在jetPEITM的介导下转染Phoenix?Ampo细胞,36 h后收集第一批病毒上清,72 h后收集第二批病毒上清,用有限稀释法感染NIH3T3细胞计数绿色荧光测病毒滴度,达到1×1011~1×1012IU/L离心过滤,存于-80℃备用.

　　1.2.2供体鼠骨髓细胞的制备尾静脉注射雄性供体BALB/c小鼠5?氟尿嘧啶（5?FU）,4 d后处死小鼠取骨髓，用DMEM预激培养基（含胎牛血清、WEHI?3B细胞上清、青霉素、链霉素、肝素、环丙沙星、L?谷氨酰胺、rmIL?3，rmIL?6和rmSCF）培养24 h后,计数有核活细胞.

　　1.2.3病毒感染骨髓原代细胞使用含500 mL/L逆转录病毒上清，10 mmol/L Hepes, 2 mg/L聚凝胺,pH 7.4 DMEM培养基,病毒和细胞在20℃,1000 g离心90 min共沉降,2~4 h的吸附后更换培养基,48 h后进行第二轮重复上述的转导和共沉降,吸附2 h后收集细胞,用D?Hank?s洗涤，计数有核活细胞.

　　1.2.4感染逆转录病毒的骨髓原代细胞的回输雌性受体小鼠照射前5 d接受抗生素直到移植后2 wk,经450 cGy的γ射线照射二次,中间休息3~6 h,照射后分4组,A组15只:输含有Mig210转染的骨髓细胞;B组10只:输含有MigR1空载的骨髓细胞；C组10只:回输经5?FU处理4 d后的供体小鼠骨髓细胞；D组10只: D?Hank?s空白对照.E组10只:未经处理的正常对照组.移植后将受体鼠于IVC层流房隔离笼饲养(符合SPF).

　　1.2.5移植小鼠成模的鉴定

　　1.2.5.1细胞形态学检查移植后,每隔3 d用剪尾法采血行外周血常规计数和外周血涂片染色分类.第4周开始每周分别取各组1只小鼠骨髓有核细胞,用PBS洗3次后将之分成3份,一份PBS洗后取沉淀涂片染色行形态学检查,一份用于提取总RNA,存于-80℃,一份参照试剂盒提取胞浆总蛋白,Bradford法测蛋白总量后存于-80℃.各组脾和肝脏组织标本也分别处理作相应检测.

　　1.2.5.2RT?PCR检测受体鼠骨髓、脾和肝脏bcr/abl融合基因mRNA的逆转录参照TakaLa RT?PCR试剂盒说明书操作步骤得cDNA.人bcr/abl融合基因上游引物为5′?GCAAGCTTACCATGGACATCCGTGG?3′,下游引物为5′?GTCGACCTTGCCATCAGAAGC?3′,扩增片段为654 bp. PCR扩增条件：94℃ 8 min，94℃ 1 min,57℃ 1 min,72℃ 90 s, 72℃ 8 min,32个循环. 小鼠的β?actin基因的上游引物为5′?ACACTGTGCCCATCTACGAG?3′,下游引物为5′?CACAGGATTCCATACCCAAG?3′, 扩增片段为 336 bp.PCR产物电泳后在数字化凝胶成像仪上观察，并做DNA测序.

　　1.2.5.3Western Blot法检测受体鼠骨髓和脾脏P210蛋白的表达提取骨髓细胞和脾脏组织蛋白, SDS?PAGE凝胶电泳分离蛋白后电转移到PVDF膜上,转印膜封闭过夜后,分别加入c?abl抗体及r?tubulin抗体,再分别加入二抗Ig?HRP,ECL法显色后于化学发光成像仪上显影并保存图像.

　　统计学处理：各组数据以x±s表示,采用SPSS11.5统计软件进行t检验.

　　2结果

　　2.1受体小鼠存活状态观察经γ射线照射的受体小鼠次日出现畏冷、恐慌、相拥缩成一团，1 wk之内出现体毛蓬松、体质量减轻较快、活动力明显减低等，这些症状在2 wk后逐渐改善. 第3月时A组小鼠皮肤开始出现出血点，第4月后相继死去.其他组小鼠中途未见死亡. 所有经γ射线照射的受体小鼠，3 wk时体质量开始恢复，毛发变柔顺、活动增加、反应灵敏、进食及饮水量增加. 

　　2.2受体小鼠血液细胞学检查外周血白细胞计数及涂片分类结果发现：经γ射线照射后的小鼠白细胞计数在0×109~0.2×109/L,外周血涂片偶见WBC,Hb,RBC等其它血常规项目与E组相比无明显改变，此后WBC数逐渐增多，第4 wk后A,B,C,D组的WBC数逐渐增加到E组水平（4.5×109~6.0×109/L）, 嗜酸粒细胞和单核细胞也稍有增多；A组到8 wk时WBC总数显著增高,外周血粒细胞明显增高(图1),血涂片粒细胞比例大于0.65并有幼稚粒细胞出现,到12 wk时WBC数已达到20×109~30×109/L,粒细胞比例达到0.80~0.90(表1),幼稚细胞甚至到达0.30，单核细胞和嗜酸粒细胞的绝对值也增多.A组小鼠的骨髓象检查发现:移植后第6 wk时骨髓增生活跃,各期的粒细胞系统增生,晚期骨髓增生极度活跃,各期的粒细胞系统显著增生,细胞形态各异,大小不一,易见早期细胞（图2）.

　　A：A组移植后7 wk； B：A组移植后12 wk； C：E组?对照组.

　　图1小鼠外周血涂片瑞氏染色 ×100（略）

　　表1A组小鼠移植后外周血涂片白细胞随时间的变化（略）

　　A：A组移植后8 wk； B： E组?对照组..

　　图2小鼠骨髓涂片瑞氏染色 ×400（略）

　　2.3小鼠造血组织病理检查A组小鼠在4 wk时脾脏开始增大，晚期有大量白血病细胞浸润(图3)，并侵及肝脏；B,C,D组的肝脾在前4 wk内无差异，由于照射后血液系统受到抑制，脾的大小相对正常组的脾缩小约0.02 g；B,C,D组肝组织切片中细胞有轻微水肿，肝血窦扩大.A组小鼠在移植12 wk后相继出血而死（图4）.

　　A：A组移植后8 wk； B： E组?对照组..

　　图3小鼠脾组织切片（箭头所指为白血病细胞）HE ×250（略）

　　2.4RT?PCR检测移植小鼠的bcr/abl融合基因第4 wk时RT?PCR检测A组受体鼠骨髓细胞和脾细胞有bcr/abl融合基因（654 bp）,到第7周时肝组织有bcr/abl融合基因（图5）,DNA测序证实序列与Mig210上的bcr/abl融合基因完全符合（图6）.其它组小鼠未检测出bcr/abl融合基因.

　　A：A组移植后6 wk小鼠； B：E组?对照组.

　　图4小鼠肝脏组织切片（箭头所指白血病细胞）HE ×250（略）

　　M1:100 bp marker;  1:A组第30日脾;  2:A组第30日骨髓;  3:A组第50日骨髓;  4:A组第50日肝;  5:A组第50日脾;  6:B组第30日骨髓;  7:B组第50日骨髓;  8:B组第50日脾;  9:C组第30日骨髓; 10:C组第50日骨髓;  11: K562细胞阳性对照L;  12: HL60细胞阴性对照;  M2:DL2000 Marker.

　　图5RT?PCR检测各组小鼠造血组织bcr/abl融合基因的表达（略）

　　图6移植小鼠造血组织bcr/abl融合基因阳性片段DNA测序结果（略）

　　2.5Western Blot法检测移植小鼠P210蛋白表达第5周时用Western Blot法检测到A组小鼠骨髓细胞和脾细胞有P210蛋白的表达，其它组未检测到有此蛋白的表达(图7).

　　1： A组小鼠骨髓 ； 2： A组小鼠脾； 3：B组小鼠骨髓； 4：D组小鼠骨髓.

　　图7Western Blot检测移植小鼠P210蛋白表达（略）

　　3讨论

　　国际上CML动物的建模方法目前主要有以下四种:①bcr/abl转化的造血细胞株在小鼠体内的定殖模型,主要用于研究bcr/abl融合基因的结构功能和药理试验；②CML原代骨髓细胞移植入免疫缺陷小鼠模型,主要适用于CML祖细胞的移植和生物学特性研究以及抗CML性研究；③bcr/abl转基因小鼠模型,主要用于模拟bcr/abl诱导的淋巴细胞白血病,且成活率低,技术含量高；④bcr/abl逆转录病毒骨髓转染/移植诱导的白血病模型,该模型主要用于研究BCR/ABL不同变异体（P190,P210和P230）和不同结构域（DD区,SH2?结合区,Dbl?like区,PH区和CalB区等）的致白血病潜能以及不同信号通路在CML发病中的作用［3-4］.结合我国目前CML小鼠模型研究的现状,本课题组构建了bcr/abl逆转录病毒介导的逆转录病毒骨髓转染/移植小鼠CML模型.

　　鉴于BALB/c小鼠对BCR/ABL诱导的白血病表现出较强的敏感性,而用其他品系的鼠作相似的实验却不能产生类似CML样疾病而最终为急性淋巴系白血病/淋巴瘤、巨噬/单核细胞系白血病,故本实验采用BALB/c小鼠品系作为实验对象.此外,因5?FU为细胞周期特异性化疗药物,主要杀伤分裂期细胞,从而可增加造血祖/干细胞的相对丰度和转染效率,而目前已有的实验结果已经表明仅被BCR/ABL转染的造血干细胞（HSC）能致CML, 故在本研究中,采用5?FU预处理实验小鼠提高HSC 丰度的策略以进一步提高建模成功率［5］.同时,本实验采用具有LTR强启动子的逆转录病毒载体表达P210BCR/ABL，以上这些改进大大提高了建模成功率［5］.与其它几种CML小鼠模型比较, bcr/abl逆转录病毒转导、移植模型系统通过简单地制备不同的病毒颗粒即可相对容易地检测不同形式和不同bcr/abl突变体的致类CML的潜能［2］,但建模过程中的转导/移植程序冗长,工作量巨大；在5?FU预处理、骨髓细胞收集、病毒包装和滴度测定、骨髓病毒转导和注射受体鼠等实验步骤均需非常小心仔细. 其次,载体中bcr/abl的表达是通过逆转录病毒的LTR启动子启动的,该启动子是一个比bcr更强的启动子,因此, bcr/abl诱导人类CML疾病模型小鼠的生存期较短［5］,尚不能完全模拟人CML患者在经受离子辐射后需要较长的潜伏期才能发生临床症状的现象.

　　本研究构建的逆转录病毒转录/移植模型系统可用于以下几个方面的研究: ①比较3种主要bcr/abl变异体－P190,P210和P230的致白血病活性；②比较BCR/ABL融合蛋白不同结构区域含突变的bcr/abl基因的致白血病活性；③检测其它基因的突变对BCR/ABL致白血病潜能的影响.

【】
  　［1］ 宋艳秋,刘敏,李薇,等. K562／NOD?SCID小鼠白血病样模型的建立［J］.实验血液学,2007,15(1)：16-19.

　　［2］ Li S, Ilaria Jr RL, Million RP, et a1.The P190, P210, and P230 forms of the BCR/ABL oncogene induce a similar chronic myeloid leukemia?like syndrome in mice but have different lymphoid leukemogenic activity ［J］. J Exp Med, 1999,189(9):1399-1412.

　　［3］ Million RP, Richard A, Etten V, et al. Van EtteThe Grb2 binding site is required for the induction of chronic myeloid leukemia?like disease in mice by the Bcr/Abl tyrosine kinase et al ［J］.Blood, 2000, 96: 664- 670.

　　［4］ Roumiantsev S, Isabel E, Varticovski L, et al. The Src homology 2 domain of Bcr/Abl is required for efficient induction of chronic myeloid leukemia?like disease in mice but not for lymphoid leukemogenesis or activation of phosphatidylinositol 3?kinase［J］. Blood, 2001, 97: 4-13.

　　［5］ Ilaria RLJ.Animal models of chronic myelogenous leukemia［J］. Hematol Oncol Clin N Am, 2004,18:525- 543.